Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em> İn Vivo</em> A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak
Summary
doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
Bu yöntemin genel amacı doğru değerlendirmek ve in vivo mikroglial fagositozda ölçümüdür. Mikroglia merkezi sinir sistemi (MSS) doku ikamet makrofajlar. Onlar doku homeostazında bakım sağlamak için çeşitli fonksiyonları gerçekleştirmek. Bunlar bağışıklık gözetim, nörotrofik faktörlerin salgılanmasına ve pivotal önemi, fagositoz 1 içerir. Mikrogliyal fagositoz gibi alakasız sinapsların (sinaptik budama) ve apoptotik nöronların 2-4 çıkarılması fagositozu olarak beyin ve retina, geliştirilmesi sırasında birçok önemli olaylar anahtarıdır. Bundan başka, hasar görmüş veya apoptotik nöronların hücresel döküntü ve istilacı mikrop mikroglial fagositoz erişkin 5 boyunca merkezi sinir sistemi homeostazın korunması için gerekli olduğu gösterilmiştir. Son olarak, mikrogliyal fagositoz Alzheimer hastalığı ve yaşa-bağlı dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde olmuşturkusurlu veya yetersiz fagositik kapasitesi amiloid-β (Aβ) plaklar ve druseni sırasıyla 6,7 birikmesi katkıda bulunabileceği öne sürülmüştür maküler dejenerasyon.
Mikroglial fonksiyon sıkı ve özellikle de tümör büyümesi faktörü p ya da hücre-hücre etkileşimleri gibi çözülebilir faktörler tarafından, bunların mikro düzenlenir. mikroglia münhasıran kendi reseptörleri CD200R ve CX3CR1 ifade ederken Nöronlar yapısal, böyle CD200 ve CX3CL1 gibi çeşitli hücre yüzey ligandları, ifade eder. Bu reseptörler, hücre içi kısmı immüno reseptör tirosin bazlı inhibisyon motifi (ITIMs) içerir. Bu reseptörler, nöro katkıda bulunabilir mikroglia aşırı stimülasyon önlemek için önemli olan inhibitör. Bu nedenle, normal fizyolojik koşullar altında, nöronlar ve mikroglia arasındaki hücre-hücre etkileşimleri hareketsiz bir durumda mikroglia tutun. Doku hasarı sırasında, ancak, nöronlar exp aşağı düzenlerBu ligandların dışarı yansıması, Mikroglia aktivitesi üzerindeki engelleyici etkisinin ortadan kaldırır. (Fagositoz dahil) mikrogliyal fonksiyonu bu yüzden sıkı bir şekilde bunların mikro 8 ile bağlantılıdır. Bununla birlikte, bugüne kadar, fizyolojik bağlamında veya tam olarak merkezi sinir sistemi mikro-kopyalayacak şekilde mikroglia fagositoz çalışma standart bir tahliller vardır.
Çeşitli deneyler birincil mikroglia veya mikroglia hücre çizgileri, hedef hücreler (örneğin, apoptotik nöronların) ya da flüoresan etiketli boncuklar ile kültürlenir in vitro, in mikroglia fagositik aktivitesini ölçmek için geliştirilmiştir. Hedef alımı daha sonra floresan görüntüleme mikroskopi kullanılarak ya da sitometri 9-12 akış değerlendirilir. Bu testler, farmakolojik veya genetik manipülasyon bilgilendirici olurken, tam in vivo ortamda karmaşık çoğaltmak için başarısız, mikroglial fagositoz etkileyebilir ve nasıl test sağlar. mikrogliyal fagositozu incelemek için dolaylı yöntemlerin vivo bildirilmiştir: Bu mikroglia ve hedefleri, fagositoz için (örneğin tehlikeye nöronlar veya sinaptik elemanların) fiziksel yakınlığı değerlendirilmesi, fagositoz (örneğin, CD68) dahil olmak üzere düşünce moleküllerin boyanması ile gerçekleştirilebilir, ya da fagositik immünohistokimyasal tespiti ile olan mikroglial hücreleri içinde hedefler (örn, Aβ) 13-17. İki çalışma in vivo mikroglia fagositoz değerlendirmek için daha doğrudan yaklaşımlar kullanmışlardır. Hughes ve arkadaşları intrakranial rota 18 ile teslim boncuk mikroglial alımını ölçmek için görüntüleme teknikleri kullandık. Sierra ve ark. Kantitatif karmaşık görüntüleme teknikleri kullanarak 4 apoptotik hücrelerin mikroglia fagositoz değerlendirmek için zarif bir yöntem geliştirdi. Bununla birlikte, bu yöntemler, doku terkibi, kesit, görüntüleme ve analiz için karmaşık bir protokol içerir. Biz daha önce dışarı fotoreseptör fagositoz değerlendirmek için akım sitometri analizi kullandıkkültür 19 retina pigment epiteli (RPE) hücreleri tarafından er segmentleri. Burada, hızla in vivo mikroglia fagositoz bir nicel ölçüsü olarak retina mikroglia tarafından floresan etiketli parçacıkları alımını değerlendirmek için bir protokol açıklar.
floresan etiketli parçacıkların (1) intravitreal teslimat, (2) hasat ve retina dokusunun hazırlanması, ve (3) akış: Biz burada açıklamak protokol güvenilir ve kantitatif üç kritik adımda hemen altında altı saat retina mikroglial fagositoz ölçümü için izin verir sitometrik analizi. Geliştirdiğimiz yöntem retinada mikroglial fagositoz değerlendirmek için sağlam bir yöntemdir ve başarıyla çeşitli bileşikler veya genetik manipülasyon fizyolojik ortamlarda bu anahtar mikroglial işlevi nasıl değiştirdiğini test etmek için kullanılır. MSS özel bir alanı olarak retina mikroglia fonksiyonu 20 incelemek için kolay ulaşılabilir bir model sistem. Bu yöntem, t geliştirilmesine rağmeno göz, biz mikroglia fagositik işlevini araştıran tüm nörologlar için yararlı olabilir inanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemde, üç önemli basamak vardır: floresan etiketli partiküllerin (1) içi enjeksiyon; (2) Ürünün alınması ve retina dokusunun hazırlanması; ve (3) flow sitometri yöntemi. Biz araştırmacıların burada mevcut yöntemin gerçekleştirmeden önce intravitreal enjeksiyonlar deneme yapmanızı öneririz. Albino farelerde (ör Balb / c) ve bir renkli çözelti (örneğin, floresan etiketli parçacıklar) iğne kolayca görselleştirme ve enjekte edilen bir çözüm kullanılabilir. Intr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
