Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em> In Vivo</em> Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo
Summary
fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
O objetivo geral deste método consiste em avaliar com precisão e quantificar na fagocitose microglial vivo. Microglia são os macrófagos residentes de tecido do sistema nervoso central (SNC). Eles desempenham uma variedade de funções para assegurar a manutenção da homeostase dos tecidos. Estes incluem a vigilância imunológica, a secreção de fatores neurotróficos e, de importância fundamental, fagocitose 1. Fagocitose microglial é fundamental em diversos eventos importantes durante o desenvolvimento do cérebro e da retina, tais como fagocitose de sinapses irrelevantes (poda sináptica) e remoção dos neurónios apoptóticas 2-4. Além disso, a fagocitose da microglia de neurónios danificados ou apoptóticas, detritos celulares, e os micróbios invasores foi demonstrado ser essencial para a manutenção da homeostase do SNC através da idade adulta 5. Finalmente, a fagocitose da microglia tem sido implicada na patogénese de várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer e Age-Relateddegeneração macular, onde tem sido sugerido que a capacidade fagocítica defeituoso ou insuficiente, podem contribuir para a acumulação de amilóide-p placas e drusas (Ap), respectivamente 6,7.
função da microglia é fortemente regulada por seu microambiente, nomeadamente por factores solúveis, tais como o factor de crescimento tumoral-β ou interacções célula-célula. Os neurónios expressam constitutivamente vários ligandos da superfície celular, tais como CD200 e CX3CL1, enquanto microglia expressam exclusivamente os respectivos receptores CD200R e CX3CR1. Esses receptores contêm imunor motivos de inibição baseada em tirosina (ITIMs) em sua porção intracelular. Estes receptores são críticos inibidor para prevenir a sobre-estimulação da microglia, que pode contribuir para neuroinflama�o. Deste modo, sob condições fisiológicas normais, a interacções célula-célula entre neurónios e microglia microglia manter num estado de repouso. Durante lesão tecidual, no entanto, os neurônios podem infra-regular expression destes ligandos, removendo o seu efeito inibidor na activação da microglia. Função da microglia (incluindo fagocitose) é, portanto, fortemente ligado ao seu microambiente 8. No entanto, até à data, não existem testes padronizados para estudar a fagocitose da microglia num contexto fisiológico ou de uma maneira que replica totalmente o seu microambiente do SNC.
Vários ensaios foram desenvolvidos para medir a actividade fagocítica de microglia in vitro, em que a microglia primárias ou linhas de células da microglia foram cultivadas com células alvo (por exemplo, neurónios apoptóticos) ou esferas marcadas com fluorescência. Captação alvo é então avaliada por microscopia de imagem fluorescente ou citometria de fluxo 9-12. Estes ensaios permitir o teste de como a manipulação genética ou farmacológica pode afectar a fagocitose da microglia e, ao mesmo tempo informativo, não conseguem replicar completamente o complexo no ambiente in vivo. Métodos indiretos para examinar a fagocitose microglialin vivo foram relatados: estes são realizadas através de coloração de moléculas que se pensa estarem envolvidos na fagocitose (por exemplo, CD68), avaliando a proximidade física da microglia e alvos para a fagocitose (por exemplo, neurónios comprometidos ou elementos sináptica), ou por detecção imuno-histoquímica de fagocítica alvos dentro das células microgliais (por exemplo, Ap) 13-17. Dois estudos usaram abordagens mais diretas para avaliar microglia fagocitose in vivo. Hughes e seus colegas usaram técnicas de imagem para medir o aporte de microglial de contas entregues por via intracraniana 18. Sierra et ai. Desenvolveram um método aperfeiçoado para avaliar quantitativamente a fagocitose da microglia de células apoptóticas, utilizando técnicas de imagem complexas 4. No entanto, estes métodos envolvem protocolos complicados para a preparação do tecido, corte, de imagem e análise. Temos anteriormente utilizada a análise de citometria de fluxo para avaliar a fagocitose de fotorreceptor para forasegmentos de er por células da retina epitélio pigmentado (RPE) em cultura 19. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a absorção rápida de marcação fluorescente partículas por microglia da retina como uma medida quantitativa da in vivo microglia fagocitose.
O protocolo aqui descrito permite a medição fiável e quantitativa da fagocitose da microglia da retina em pouco menos de seis horas em três passos críticos: (1) a entrega intravítrea de partículas marcado por fluorescência, (2) da colheita e da preparação de tecido retiniano, e (3) o fluxo A análise de citometria. O método que desenvolvemos é um método robusto para avaliar a fagocitose da microglia na retina, e pode ser utilizado com sucesso para testar como vários compostos ou manipulação genética alterar esta função chave na microglia configurações fisiológicas. Como uma área especializada do sistema nervoso central, a retina é um sistema modelo facilmente acessível para estudar a função microglia 20. Enquanto este método foi desenvolvido no tele olho, acreditamos que ele pode ser útil para todos os neurocientistas que investigam função microglia fagocítica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem três passos críticos neste método: (1) injecção intravítrea de partículas marcado por fluorescência; (2) a colheita e preparação do tecido da retina; e (3) análise de citometria de fluxo. Recomendamos que os pesquisadores praticar injeções intravítreas antes de realizar o método que aqui apresentamos. Murganhos albinos (por exemplo, murganhos BALB / C) e uma solução de cor (por exemplo, partículas marcadas por fluorescência) pode ser utilizado para facilitar a visualização …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
