Enregistrement Gamma Band Oscillations dans pédonculopontin Nucleus Neurones
Summary
Le noyau pédonculopontin (PPN) est situé dans le tronc cérébral et ses neurones sont au maximum activé lors d'éveil et de mouvements oculaires rapides (REM) cerveau de sommeil états. Cet ouvrage décrit l'approche expérimentale pour enregistrer in vitro bande gamma oscillation de la membrane subliminale dans les neurones PPN.
Abstract
Efférents synaptiques de la PPN sont connus pour moduler l'activité neuronale de plusieurs régions thalamiques intralaminaires (par exemple, le centrolateral / parafasciculaire; Cl / Pf noyau). L'activation soit du PPN ou noyaux Cl / Pf in vivo a été décrite pour induire l'éveil de l'animal et une augmentation de l'activité de la bande gamma dans l'électroencéphalogramme corticale (EEG). Les mécanismes cellulaires pour la production d'oscillations de la bande gamma à système d'activation réticulaire (RAS) neurones sont les mêmes que ceux trouvés pour générer gamma oscillations de la bande dans d'autres cerveaux noyaux. Pendant l'enregistrement courant clamp de neurones PPN (provenant parasagittales tranches de 9-25 jours d'âge des rats), l'utilisation de dépolarisation étapes carrés activée rapidement les canaux potassiques voltage-dépendants qui ont empêché les neurones PPN d'être dépolarisée au-delà de -25 mV.
Injecter 1 – 2 sec dépolarisants à long rampes actuelles progressivement dépolarisée PPN membranaires res potentielsting valeurs vers 0 mV. Cependant, l'injection de dépolarisation des impulsions carrées générées oscillations gamma-bande du potentiel de membrane qui ont montré à être plus petite en amplitude par rapport aux oscillations produites par des rampes. Toutes les expériences ont été réalisées en présence des canaux sodiques voltage-dépendants et rapide des récepteurs synaptiques bloquants. Il a été démontré que l'activation des canaux calciques voltage-dépendants à seuil élevé sous-tendent l'activité de la gamma-bande oscillatoire dans les neurones PPN. Interventions méthodologiques et pharmacologiques spécifiques sont décrites ici, en fournissant les outils nécessaires pour induire et maintenir PPN subliminale bande gamma oscillation in vitro.
Introduction
PPN noyau est anatomiquement inclus dans le tegmentum mésencéphalique caudale. Le PPN est une composante clé de la RAS 1. Le PPN participe au maintien des états activés de comportement (c. -à- veille, le sommeil paradoxal) 2. La stimulation électrique du PPN in vivo induite par oscillation rapide (20 – 40 Hz) dans l'EEG cortical 3, tandis que les lésions bilatérales PPN chez le rat réduit ou éliminé le sommeil paradoxal 4. Alors que la majorité des neurones PPN feu potentiels d'action à la fréquence bêta / gamma-bande (20 – 80 Hz), certains neurones ont présenté des taux de décharge spontanée faible (<10 Hz) 5. En outre, le PPN semble être impliqué dans d' autres aspects du comportement tels que la motivation et l' attention 6. Haute fréquence directe (40 – 60 Hz) 7 stimulation électrique du PPN noyau chez les animaux décérébrés peut favoriser la locomotion. Ces dernières années, la stimulation cérébrale profonde (DBS) de PPN a été utilisé pour traiter les patients souffrant from troubles impliquant des déficits de la marche tels que la maladie (PD) 8 Parkinson.
Les rapports précédents ont montré que presque tous les neurones PPN peuvent tirer des potentiels d'action au gamma fréquence de la bande lorsque dépolarisée en utilisant des impulsions de courant 9 carrés. En raison de l'activation drastique des canaux potassiques voltage-dépendants lors des impulsions carrées dépolarisations jusqu'à ou sous -25 mV. En conséquence, aucune oscillation gamma solides ont été observées après le blocage de la génération de potentiels d'action en utilisant 10 la tétrodotoxine. Dans un effort pour contourner un tel problème, 1 – 2 sec dépolarisants à long rampes actuelles ont été utilisés. Dépolarisées rampes progressivement le potentiel de membrane de repos des valeurs allant jusqu'à 0 mV, tandis que inactivant partiellement les canaux potassiques voltage-dépendants. Effacer les oscillations de la membrane de la bande gamma étaient évidents dans la fenêtre de la dépendance de la tension des canaux calciques seuil haut (entre -25 mV et -0 mV) 10. En conclusion, la bande gamma activity a été observée dans les neurones PPN 9, et les deux P / Q- et les canaux calciques voltage-dépendants de type N doivent être activés afin de générer des oscillations de la bande gamma dans le PPN 10.
Une série d'études a déterminé l'emplacement des canaux calciques seuil haut dans les neurones PPN. Injecter la combinaison de colorants, l' imagerie de fluorescence ratiométrique a montré des transitoires de calcium par les canaux calciques voltage-dépendants qui sont activés dans différents dendrites lorsque dépolarisée en utilisant des rampes de courant 11.
Les propriétés intrinsèques des neurones PPN ont été proposées pour permettre l'activation simultanée de ces cellules pendant l'éveil et le sommeil paradoxal, induisant ainsi à haute fréquence oscillatoire activité neuronale entre la RAS et les boucles thalamocorticales. Cette interaction de longue portée est considérée pour soutenir un état du cerveau capable d'évaluer de manière fiable le monde autour de nous sur une base continue 12. Ici, nous décrivons l'expérienceconditions al nécessaires pour générer et maintenir gamma bande oscillation dans les cellules PPN in vitro. Ce protocole n'a pas été décrit précédemment, et aiderait un certain nombre de groupes pour étudier les propriétés des membranes intrinsèques responsables de l'activité de la bande gamma à d'autres zones du cerveau. En outre, les mesures actuelles pourraient conduire à la conclusion erronée que l'activité de la bande gamma ne peut être générée dans ces cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neurones PPN ont des propriétés intrinsèques qui leur permettent de tirer des potentiels d'action à des fréquences de la bande bêta / gamma pendant les enregistrements in vivo à partir d' animaux qui sont éveillés ou pendant le sommeil paradoxal, mais pas pendant le sommeil lent 2,3,5,13-17. D'autres auteurs ont montré que les transections du tronc cérébral à plusieurs niveaux antérieurs à PPN réduit les fréquences gamma pendant les enregistrements EEG. Cependant, lorsque…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by core facilities of the Center for Translational Neuroscience supported by NIH award P20 GM103425 and P30 GM110702 to Dr. Garcia-Rill. This work was also supported by grants from FONCYT-Agencia Nacional de Promociòn Cientìfica y Tecnològica; BID 1728 OC.AR. PICT-2012-1769 and UBACYT 2014-2017 #20120130101305BA (to Dr. Urbano).
Materials
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | C12H22O11, molecular weight = 342.30 |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | NaHCO3, molecular weight = 84.01 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | KCl, molecular weight = 74.55 |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | MgCl2 · 6H2O, molecular weight = 203.30 |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | C6H12O6, molecular weight = 180.16 |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | C6H8O6, molecular weight =176.12 |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | NaCl, molecular weight = 58.44 |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | C6H11KO7, molecular weight = 234.25 |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma-Aldrich | P1937 | C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight = 453.38 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | [-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40 |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma-Aldrich | A9187 | C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18 |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18 |
| Tetrodotoxin citrate | Alomone Labs | T-550 | C11H17N3O8, molecular weight = 319.27 |
| DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid | Sigma-Aldrich | A5282 | C5H12NO5P, molecular weight = 197.13 |
| CNQX disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | C239 | C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12 |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | C21H22N2O2, molecular weight = 334.41 |
| Mecamylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | M9020 | C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75 |
| Gabazine (SR-95531) | Sigma-Aldrich | S106 | C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23 |
| Ketamine hydrochloride | Mylan | 67457-001-00 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600FN | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | ROE-200 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| A/D converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Heater | Warner Instruments | TC-324B | |
| Pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S 7519-20 | |
| Pump cartridge | Cole-Parmer | Masterflex 7519-85 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Camera | Q-Imaging | RET-200R-F-M-12-C | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200 S | |
| Refrigeration system | Vibratome Instruments | 900R | |
| Equipment | |||
| microscope | Nikon | Eclipse E600FN | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | ROE-200 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| A/D converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| heater | Warner Instruments | TC-324B | |
| pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S 7519-20 | |
| pump cartridge | Cole-Parmer | Masterflex 7519-85 | |
| pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| camera | Q-Imaging | RET-200R-F-M-12-C |
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