Summary
pedunculopontine çekirdeği (PPN) beyin sapı bulunur ve nöronlar maksimum uyanma ve hızlı göz hareketleri (REM) uykusu beyin devletler sırasında aktive edilir. Bu eser PPN nöronlar in vitro gama bandı eşik altı membran salınım kayıt için deneysel bir yaklaşım anlatılmaktadır.
Abstract
(Cı / PG çekirdeği, örneğin, centrolateral / parafascicular) PPN sinaptik efferentler birçok intralaminar talamik bölgelerin nöronal aktivitenin modüle bilinmektedir. PPN veya in vivo Cı / PG çekirdekleri ya aktivasyonu hayvanın uyarılma ve kortikal elektroansefalogram (EEG) gama bandı aktivitesinde bir artış uyarılması için tarif edilmiştir. Retiküler Aktive Sistemde gama bandı salınımları üretimi için hücresel mekanizmalar (RAS) nöronlar diğer beyinleri çekirdeklerde gama bandı salınımlarını oluşturmak için bulunanlarla aynıdır. (9 dan parasagital dilim - 25 gün eski sıçan) PPN nöronlarının akım kelepçe kayıtları sırasında, kare adımlar depolarizan kullanımı hızla -25 mV ötesinde depolarize olmaktan PPN nöronlar engelledi voltaj bağımlı potasyum kanallarını aktive.
1 enjekte - uzun cari rampaları depolarizan 2 sn yavaş yavaş PPN zar potansiyeli res depolarizeting 0 mV doğru değerleri. Ancak, enjekte depolarizan kare bakliyat rampalar tarafından oluşturulan salınımlar kıyasla genlik küçük olması gösterdi membran potansiyelinin gama-bant salınımlar oluşturdu. Bütün deneyler, voltaj bağımlı sodyum kanalı ve hızlı sinaptik reseptörleri bloke edicilerin mevcudiyetinde gerçekleştirilmiştir. Yüksek eşikli gerilime-bağlı kalsiyum kanallarının aktivasyonu PPN nöronlarda y-bant salınımlı aktivitesi altında yatan gösterilmiştir. Spesifik metodolojik ve farmakolojik müdahalelerin neden ve in vitro PPN eşikaltı gama bandı salınımını sürdürmek için gerekli araçları sağlayarak, burada açıklanmıştır.
Introduction
PPN çekirdeği anatomik kaudal Mezensefalik tegmentumdaki dahildir. PPN RAS 1 önemli bir bileşenidir. PPN (uyanma, REM uykusu yani) 2 davranışsal aktif devletlerin bakım katılır. Sıçan bilateral PPN lezyonların azalır veya REM uykusunu 4 elimine ederken, kortikal EEG 3 - (40 Hz 20) in vivo PPN'nin elektrik stimülasyonu hızlı salınım kaynaklı. PPN nöronların çoğunluğu beta / gama-bant frekansı aksiyon potansiyelleri ateş ederken (20-80 Hz), bazı nöronlar spontan ateşleme düşük oranlar sundu (<10 Hz) 5. Ayrıca, PPN gibi motivasyon ve dikkat 6 gibi davranış diğer yönleri dahil olmak görünüyor. Doğrudan yüksek frekans (40 - 60 Hz) deserebre hayvanlarda PPN çekirdeğinin 7 elektrik stimülasyonu hareketlilik teşvik edebilir. Son yıllarda, derin beyin stimülasyonu (DBS) PPN'nin sağa sola şikayet eden hastaları tedavi etmek için kullanılır olmuşturParkinson hastalığı (PH) 8 olarak yürüyüş açıkları kapsayan m bozukluklar.
Önceki raporlar kare akım darbeleri 9 kullanılarak depolarize zaman neredeyse tüm PPN nöronlar gamma bant frekansı aksiyon potansiyelleri ateş göstermiştir. Çünkü mV kadar veya -25 altında kare bakliyat depolarizasyonlarından sırasında voltaj bağımlı potasyum kanallarının şiddetli aktivasyon. Bunun bir sonucu olarak, herhangi bir güçlü gama salınımlar Tetrodotoksin 10 kullanılarak aksiyon potansiyelleri nesil engelleme sonra gözlenmiştir. Böyle bir sorun atlamak için bir çaba, 1 - uzun cari rampaları depolarizan 2 sn kullanıldı. Kısmen voltaj bağımlı potasyum kanallarını inaktive ederken Rampaları yavaş yavaş, 0 mV kadar değerleri istirahat membran potansiyeli depolarize. Net gama bandı membran salınımlar 10 (-25 mV ve -0 mV arasında, yani) yüksek eşik kalsiyum kanallarının voltaj bağımlılığı penceresi içinde belirgindi. Sonuç olarak, gama bandı olduğu faaliyetlerty PPN nöronlar 9 gözlendi ve her iki P / Q ve N-tipi voltaj bağımlı kalsiyum kanalları PPN 10 gama bant salınımları oluşturmak amacıyla aktive edilmesi gerekir.
bir dizi çalışma PPN nöronlarda yüksek eşik kalsiyum kanallarının yerini tespit edilmiştir. Boyaların kombinasyonunu enjekte oranlı metrik floresan görüntüleme geçerli rampalar 11 ile depolarize zaman farklı dendritler aktive edilir voltaj kapılı kalsiyum kanalları aracılığıyla geçici kalsiyum gösterdi.
PPN nöronların içsel özellikleri dolayısıyla RAS ve talamokortikal döngüler arasında yüksek frekanslı titreşimli nöronal aktiviteyi uyaran, uyanma ve REM uykusu sırasında bu hücrelerin simultane aktivasyonu izin öne sürülmüştür. Bu tür uzun erimli bir etkileşim güvenilir bir şekilde sürekli olarak 12 etrafımızdaki dünya değerlendirebilecek bir beyin durumunu desteklemek için kabul edilir. Burada, biz denemeyi tarifGerekli al koşulları oluşturmak ve in vitro PPN hücrelerinde gama bandı salınımını korumak için. Bu protokol daha önce tarif edilmemiştir, ve diğer beyin alanlarında gama bandı aktivitesini aracılık içsel membran özelliklerini incelemek için grupların bir dizi yardımcı olacaktır. Ayrıca, mevcut adım y bandı aktivitesi bu hücrelerde üretilen edilemez hatalı sonuca yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel protokoller Arkansas Tıbbi Bilimler Üniversitesi (Protokol numarası # 3593) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin Sağlık kılavuzların National Institutes ile anlaşma idi.
Standart yapay beyin omurilik sıvısının hazırlanması 1. (CSF)
- Stok Çözeltisi A Hazırlanması
- kimyasal ilave edilmeden önce, temiz bir 1 L'lik bir kap için distile su, 700 ml ilave edilir.
- Sürekli 500 ml bir hacme karıştırılırken, NaCI 136,75 g KCI 6.99 g, MgSO 4 2.89 g, ve NaH 2 PO 4 2.83 g ekleyin.
- Seyreltildikten sonra 1 L bir son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 117 mM NaCI, 4.69 mM KCI olduğu, 1.2 ila 4 mm MgSO, ve 1.18 mM NaH 2 PO 4.
- 2 hafta boyunca 4 ° C'de buzdolabında tutun.
- Stok Çözeltisi B'nin Hazırlanması
- kimyasal ilave edilmeden önce, temiz bir 1 L çanağa damıtılmış 700 ml su ekleyin.
- Sürekli 500 ml bir hacme karıştırılırken, D-glukoz 41.45 g NaHCO 3 41.84 g ekleyin.
- Seyreltildikten sonra 1 L bir son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 11.5 mM D-glikoz ve 24.9 mM NaHCO 3'tür.
- 2 hafta boyunca 4 ° C'de buzdolabında tutun.
- Her deney karışımı önce 50 50 ml stok B ile stok ml sürekli karbojen (-% 5 CO2 karışımı% 95 O 2) ile oksijene ederken nihai konsantrasyon aCSF solüsyon elde etmek ve oda sıcaklığında bırakın damıtılmış su ile 1 L'ye getir en az 30 dakika karıştırıldı. Sadece her bir deney başında nihai konsantrasyon aCSF hazırlayın ve günün sonunda atın.
Sakkaroz-yapay beyin omurilik sıvısının 2. Hazırlık(Sakroz-CSF)
- Stok Çözeltisi C hazırlanması
- kimyasal ilave edilmeden önce, temiz bir 1 L'lik bir kap için distile su, 700 ml ilave edilir.
- Sürekli damıtık su 500 mi karıştırılırken, sükroz, 240 g, NaHCO 3 6.55 g, KCI 0.671 g, MgCl2 4.88 g, CaCI2 0.22 g askorbik asit, 0.21 g ekleyin.
- Seyreltildikten sonra 1 L bir son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 701,1 mM sakaroz, 78 mM NaHCO 3, 9 mM KCI, 24 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2 ve 1.2 mM askorbik asit .
- en fazla bir hafta boyunca 4 ° C'de stok çözeltisi C tutun.
- Her deney karışımı önce sürekli bir karbojen (% 95 O 2-5% CO2 karışımı) ile oksijene ise son konsantrasyonda sukroz-CSF çözelti elde etmek ve oda sıcaklığında bırakın distile su, 600 ml stok C, 50 ml, 300 mi en az 30 dakika karıştırıldı.
3. Dilim Hazırlık
- karbojen ile oksijene, buz içinde 100 mi sükroz aCSF çözeltisi ile temiz bir beher yerleştirilir ve 0.1 M NaOH solüsyonu birkaç damla eklenirken bir pH metre kullanılarak 7.4 pH düzeltme (zaman pH <7.4) ya da 0.1 M HCI çözeltisi ( pH> 7.4).
- sakaroz-aCSF ile bir vibratome bir kesim odasına kadar doldurun ve oksijen. Kesme odasına bağlanmış gliserol tabanlı soğutma sistemi açın ve 0 kadar soğuması için 15 dakika bekleyin - 4 ° C.
- (; <50 ul son hacim ile 70 mg / kg, ip), Ketamin ile (yetişkin Zamanlı gebe Sprague-Dawley fareleri ile 12 yaş 9) yavrular anestezisi. yavru sakin olduğunda, çift o kuyruk tutam refleks yoktur edin.
- yavrular başını kesmek.
- Bir karbonlu çelik neşter bıçak kullanarak geri ve forseps kullanarak yanlara cilt çekin önden uzunlamasına kafa cildi kesin. sc hareketli beyini çevreleyen kemik kesmekyanal issors ve tamamen beyin açığa çıkarın.
- Sonra hızla (başlangıçta hafifçe en kaudal alanlara doğru en rostral beyni dışarı itmek için koku ampul altına) bir spatula kullanarak beyin kaldırmak. Yavaşça buzla soğutulmuş oksijenli sükroz yapay beyin omurilik sıvısı (sükroz-CSF) içine beyin itin.
- (Yarımkürede yaklaşık üçte birini öldürmesi) sağ hemisfer bir parasagital kesim olun ve manyetik içeren sagital 400 mikron bölümleri kesmek için bir vibroslicer kesme odasına sabit olacak bir metalik diske beynin kesilmiş tarafını tutkal pedunculopontine çekirdeği (PPN). bütün hücre patch-clamp kayıtları önce 45 dakika boyunca oda sıcaklığında PPN dilimleri tutun.
PPN Dilimleri 4. Kayıtlar Gamma-bant Salınımlılığı
- Potasyum glukonat hücre içi Çözüm hazırlanması (High-K + Çözümü)
- Yerleştirmekdistile su 10 ml ile temiz bir beher buz. K + -gluconate, 90,68 mg phosphocreatine di Tris tuz, 47.66 mg HEPES, 1.5 mg EGTA, 40.58 mg Mg 2+ ATP ve 4 mg Na + 2 -GTP: Sürekli eklemek karıştırırken.
- KOH 7.3 (damıtılmış su içinde 100 mM), pH ayarlama. 20 mL'lik bir son hacme ulaşmak için saf su ekle. 290 mOsm - gerekli olduğunda, 280 olarak sakaroz (damıtılmış su içinde 100 mM) ile, ozmolarite ayarlayın. Seyreltildikten sonra, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 124 mM K + -gluconate olan, 10 mM fosfokreatin di Tris tuzu, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 4 mM Mg2 + -ATP ve 0.3 mM, Na + 2 -GTP.
- Kısım hücre 1 ml tüpler çözeltiler ve dondurularak -20 ° C'de ilave edildi. günde bir kısım kullanın ve deneyler süresince 4 ° C'de tutun.
- Tüm hücre yama Kelepçe Kayıtlar
- bir daldırma bölmesi dilimleri yerleştirin ve oksijenli ile (1.5 mL / dakika) ile perfüze(% 95 O2 - CO2,% 5), aşağıdaki reseptör antagonistlerini içeren CSF: Selektif NMDA reseptör antagonisti, bir 2-amino-5-phosphonovaleric asit (APV, 40 uM), rekabetçi AMP A / kainat bir glutamat reseptör antagonisti 6-siyano-7- nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX, 10 uM), glisin reseptör antagonisti striknin (STR, 10 uM), belirli bir GABA A reseptör antagonisti gabazine (GBZ, 10 uM) ve sodyum kanal bloke tetrodoksin (TTX 3μM)
NOT: sonuçlar ve rakamlar, bu antagonistleri toplu olarak sinaptik bloker veya SBs adlandırılır. - Kayıt yama pipetler dolgu, bir ticari olarak elde edilebilen parça pipet dolgu maddeleri kullanılarak hücre içi yüksek K + çözeltisi (Direnç 2-7 MQ 1,0 mm dış çapı ve 0.6 mm iç çap normal, ticari olarak temin edilebilir kalın duvarlı borosilikat cam kılcal yapılmış) çözelti filtre. onun amplifikatörün tutucu pipet yerleştirin. Küçük bir pos uygulaBir üç yollu vanaya bağlı bir silikon tüp kullanılarak pipet sahibine bağlı 1 ml'lik şırınga ile gösterilmiş pozitif basıncı. Bir yama kelepçe amplifikatör pipet tutucu arka bağlayın.
- yakın kızılötesi diferansiyel girişim kontrast optik kombine bir 4X objektif kullanılarak PPN çekirdeğe yakın bir mekanik mikromanipülatör kullanarak kayıt pipet hareket ettirin.
NOT: PPN çekirdeği superior serebellar sapı ile dilimler dorsal görülebilir (SCP; akson kalın bir paket olarak gözlemlenebilir). Kayıt pipetler PPN'nin yerleşmişti sapı arka ucuna dorsal hemen bulunduğu compactadaki, pars. - 40X suya daldırma lens kullanarak görüntülenmiştir iken PPN nöron ile temas halinde kayıt pipet getirin ve hızla hücre ile bir mühür formu negatif emiş uygulanır.
- Üreticinin protokolü kullanılarak negatif emme sırasında pipet direnci izlemek için gerilim kelepçe mühür yazılımını kullanın.
- Ne zaman olumsuz suction yavaş yavaş artar ve pipet ucu yama-kelepçe monitör tarafından okuma direnç değerleri 80 ulaşır - hızla mV -50 ve negatif basınç serbest tutma potansiyeli değiştirmek, 100 Mohm. Sürekli nöronun membran ve elektrik ile erişim tam hücre konfigürasyonunda elde edilir yırtılma girene kadar, emme uygulamak başlayın.
- gerilim kelepçe mühür yazılımı ile ölçülen erişim direnç değerleri 10 MOhm veya daha yüksek ise, o zaman küçük miktarlarda negatif emme uygulayarak devam edin.
- Kapasitans telafi gerilim kelepçe modunda ve seri direnç (yani, yavaş ve hızlı geçici hücrenin zarı kırılması sonra gözlenen). Köprü değerleri telafi hızla geçerli kelepçe kayıt moduna geçmek ve (örneğin, amplifikatör düğmesini taşımak veya computer's fareyi kullanarak otomatik kompanzasyon menüsünü tıklayın).
- PPN nöronun sürekli dinlenme monitörü zar potansiyeli u kaydediliyorüreticinin protokolünü şarkı. depolarizan veya hiperpolarizan değerlere doğru membran potansiyeli kayması istirahat, daha sonra optimum -50 mV nihai değerini tutmak için doğru akım (100 pA kadar) küçük miktarlarda kullanın.
NOT: -48 mV istikrarlı istirahat membran potansiyeli (RMP) veya daha fazla hiperpolarize (yani, RMP <-48 mV) ile sadece PPN nöronlar tutun.
- PPN nöronun sürekli dinlenme monitörü zar potansiyeli u kaydediliyorüreticinin protokolünü şarkı. depolarizan veya hiperpolarizan değerlere doğru membran potansiyeli kayması istirahat, daha sonra optimum -50 mV nihai değerini tutmak için doğru akım (100 pA kadar) küçük miktarlarda kullanın.
- bir daldırma bölmesi dilimleri yerleştirin ve oksijenli ile (1.5 mL / dakika) ile perfüze(% 95 O2 - CO2,% 5), aşağıdaki reseptör antagonistlerini içeren CSF: Selektif NMDA reseptör antagonisti, bir 2-amino-5-phosphonovaleric asit (APV, 40 uM), rekabetçi AMP A / kainat bir glutamat reseptör antagonisti 6-siyano-7- nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX, 10 uM), glisin reseptör antagonisti striknin (STR, 10 uM), belirli bir GABA A reseptör antagonisti gabazine (GBZ, 10 uM) ve sodyum kanal bloke tetrodoksin (TTX 3μM)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başlangıçta, gama salınımlar kare akım darbeleri kullanarak uyarılmış bulundu. Sinaptik bloker ve TTX huzurunda PPN nöronların Güncel kelepçe kayıt sürekli istirahat membran potansiyeli ~ -50 mV (Şekil 1A) istikrarlı tutuldu sağlamak için izlenmiştir. İki saniyelik kare akım darbeleri 200 Pa ila 600 Pa (Şekil 1A) genliği artan kayıt pipet ile yama kelepçe amplifikatör tarafından hücre enjekte edilmiştir. Membran potansiyeli -20 mV yakın gerilim seviyelerine depolarize zaman 600 pA, küçük genlikli gama salınımları ile sonuçlanır. Gama salınımlarının Yetkileri spektrumları çok küçük genlikli değerlerini sundu (yani <0.01; Şekil 1B). Öte yandan, iki adet ikinci depolarizasyon akımı rampalar sağlam y titreşimler üretmek kayıt pipet ile yama kelepçe amplifikatör tarafından hücre enjekte edilmiştirDaha yüksek bir güç amplitüdleri sunulmaktadır (Şekil 2A) (Şekil 2B).
Önceki çalışma 10 meydanda arasındaki farkları bağlantılı ve eski ani depolarizasyon sırasında voltaj bağımlı potasyum kanallarının dize aktivasyonuna mevcut protokolleri rampa vardır. Yavaş depolarizan rampaları yerine potasyum kanallarını inaktive olabilir.
Tüm hücre Şekil 1. Membran Titreşimler Genlik Artırılması Güncel Meydanı Bakliyat kullanarak PPN Nöronlar kaydedildi. Sinaptik bloker ve TTX varlığında, kayıt pipet aracılığıyla yama kelepçe amplifikatör tarafından hücre enjekte artan genlik 2 sn uzun kare adımlar depolarizan (A) Temsilcisi membran potansiyeli yanıtları. (B) Çakışandepolarizan adımlarla tarafından oluşturulan 60 Hz bant geçiren filtreleme salınımları - A.Gücü spektrumları gösterilen kare darbeleri kullanılarak elde edilen salınımlar için güç spektrumu amplitüdleri 20 sonra Hamming pencere fonksiyonu kullanılarak elde edilmiştir. PPN nöron yüksek K + hücre içi çözüm ve TTX Protokolde tanımlanan sinaptik bloker + birleştirerek akım kelepçe konfigürasyonunda kaydedildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tüm-hücrede Şekil 2. Gama Band Membran Titreşimler artırmada Genlik Güncel Rampaları kullanarak PPN Nöronlar kaydedildi. Hücre kayıt pipet, gösterisi ile yama kelepçe amplifikatör tarafından enjekte 2 sn uzun rampalar depolarizan (A) Temsilcisi membran potansiyeli yanıtları60 Hz bant geçiren filtreleme salınımlar depolarizan rampa tarafından oluşturulan -. 20 sonra sinaptik bloker ve TTX varlığında genlik artan ing (B) A. Gücü spektrumları gösterilen rampaları kullanılarak elde salınımlar için güç spektrumu genlikleri Çakışan bir Hamming pencere fonksiyonu kullanılarak elde edilmiştir . PPN nöron yüksek K + hücre içi çözüm ve TTX Protokolde tanımlanan sinaptik bloker + birleştirerek akım kelepçe konfigürasyonunda kaydedildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PPN nöronlar onları uyanık ya da REM uykusu sırasında değil, yavaş dalga uykusu 2,3,5,13-17 sırasında olan hayvanlardan elde in vivo kayıtları sırasında beta / gama bandı frekanslarında aksiyon potansiyelleri ateş izin içsel özelliklere sahiptir. PPN EEG kayıtları sırasında gama frekansları azaltılmış dışında yazarlar daha ön seviyelerinde olduğu beyin sapı terimleri göstermiştir. Beyin sapı lezyonları bu çekirdek bulunduğu yere posterior Ancak, PPN'nin doğrudan uyarılması EEG 2,3,5,18-21 kortikal gama aktivitesinin tezahürü izin verdi. Gama bant sinirsel aktivite 24 locomoting zaman primatlarda PPN alanında, in vivo 3 kedi, (PPN 23 projeleri hangi) sıçan REM uyku indüksiyon alanında, in vitro 22 fare PPN rapor ve olmuştur 25 adım sırasında insanlarda PPN'nin bölgede. Bu gama bandı etkinliği i için yeterli kanıt yoktur, olduğunun türler arasında PPN.
Burada ayrıntılı Bu deneysel protokol, tüm sıçan PPN hücre tipleri 10 mevcut gama salınımlarının açıklamasına izin verdi. tip I, II ve III veya verici: Aslında, iç mekanizmaları altında yatan gama salınımları ne olursa olsun önceki kullanılan sınıflandırmalar veya sinaptik verici Çeşidi (PPN etrafında hücreleri bu özelliği paylaşan yok ederken) her PPN nöron bulunması anlatıldı tipi, kolinerjik, glutamaterjik veya GABAerjik özelliği 10 üreten aynı gama-band paylaşıyoruz. Geçerli rampaları kullanımı deney boyunca istirahat membran potansiyeli sürekli izlenmesi ve kalıcı köprü tazminat gerektiren sınırlama vardır. Rampa süreler 5 saniye ya da daha uzun deney sırasında kompanse kalacak membran direnci değişikliklere neden Bazı durumlarda, 1 saniyeden daha kısa rampalar, tam olarak voltaj geçitli kalsiyum kanalı aktive gözlenmiştir. durumda nRampa süresi o gama salınımları gözlendi, küçük ayarlamalar gama bandı salınım genlikleri artırmak olabilir.
Bu PPN hücreleri (~% 50) N- ve P / Q tipi bloke edici önemli bir kısmının bu tarif spesifik toksinlerle akım rampaları depolarize edici birleştiren kanalların kalsiyum kanalları indirgenmiş y salınım (ω-CgTx ve ω-Ağa her ikisini de kullanarak) P / Q- ve N-tipi hücreleri olarak sınıflandırılmış bize izin genlik. diğer hücreler (% 20), gama salınımları sadece bu hücrelerin sadece P / Q tipi kanalları dile düşündüren, ω-Ağa tarafından etkilenmiştir. hücreleri (% 30) sadece geri kalanında co-CgTx bu PPN nöronlar sadece N tipi kanalları vardı düşündüren, onları engelledi. Bu sonuçlar, farklı voltaj bağımlı kalsiyum kanallarının 26,27 ifadesi ile gama bandı salınımlar tezahür PPN hücrelerin varlığını doğruladı. Bu yeni protokol aynı zamanda yeni bir PPN hücre typ giriş izin önemli bir araç olarak kabul edilebiliralanına e sınıflandırılması. Aslında, sadece uyanma sırasında N-tipi sadece PPN nöronlar REM uykusunda ( "REM-on"), P / Q tipi boyunca sadece yangın olduğu öne sürülmüştür ( "Wake-on"), ya da N tipi + U / uyanma ve REM uykusu ( "Wake / REM-on") 26,27 hem sırasında Q-tipi. Ayrıca, bu protokol diğer beyin bölgelerinde titreşimli aktivite tanımlamak ve bunları tetikleme iç özelliklerini göstermek için, gelecekteki deneylerde kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | C12H22O11, molecular weight = 342.30 |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | NaHCO3, molecular weight = 84.01 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | KCl, molecular weight = 74.55 |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | MgCl2 · 6H2O, molecular weight = 203.30 |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | C6H12O6, molecular weight = 180.16 |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | C6H8O6, molecular weight =176.12 |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | NaCl, molecular weight = 58.44 |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | C6H11KO7, molecular weight = 234.25 |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma-Aldrich | P1937 | C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight = 453.38 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | [-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40 |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma-Aldrich | A9187 | C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18 |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18 |
| Tetrodotoxin citrate | Alomone Labs | T-550 | C11H17N3O8, molecular weight = 319.27 |
| DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid | Sigma-Aldrich | A5282 | C5H12NO5P, molecular weight = 197.13 |
| CNQX disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | C239 | C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12 |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | C21H22N2O2, molecular weight = 334.41 |
| Mecamylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | M9020 | C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75 |
| Gabazine (SR-95531) | Sigma-Aldrich | S106 | C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23 |
| Ketamine hydrochloride | Mylan | 67457-001-00 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600FN | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | ROE-200 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| A/D converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Heater | Warner Instruments | TC-324B | |
| Pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S 7519-20 | |
| Pump cartridge | Cole-Parmer | Masterflex 7519-85 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Camera | Q-Imaging | RET-200R-F-M-12-C | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200 S | |
| Refrigeration system | Vibratome Instruments | 900R | |
| Equipment | |||
| microscope | Nikon | Eclipse E600FN | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | ROE-200 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| A/D converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| heater | Warner Instruments | TC-324B | |
| pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S 7519-20 | |
| pump cartridge | Cole-Parmer | Masterflex 7519-85 | |
| pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| camera | Q-Imaging | RET-200R-F-M-12-C |
References
- Profice, P., et al. Neurophysiological evaluation of the pedunculopontine nucleus in humans. J. Neural. Transm (Vienna). 118 (10), 1423-1429 (2011).
- Steriade, M., Datta, S., Pare, D., Oakson, G., Curro Dossi, R. C. Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems. J. Neurosci. 10 (8), 2541-2559 (1990).
- Steriade, M., Dossi, R. C., Pare, D., Oakson, G. Fast oscillations (20-40 Hz) in thalamocortical systems and their potentiation by mesopontine cholinergic nuclei in the cat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (10), 4396-4400 (1991).
- Deurveilher, S., Hennevin, E. Lesions of the pedunculopontine tegmental nucleus reduce paradoxical sleep (PS) propensity: evidence from a short-term PS deprivation study in rats. Eur. J. Neurosci. 13 (10), 1963-1976 (2001).
- Steriade, M., Pare, D., Datta, S., Oakson, G., Curro Dossi, R. Different cellular types in mesopontine cholinergic nuclei related to ponto-geniculo-occipital waves. J. Neurosci. 10 (8), 2560-2579 (1990).
- Steckler, T., Inglis, W., Winn, P., Sahgal, A. The pedunculopontine tegmental nucleus: a role in cognitive processes? Brain Res. Brain Res. Rev. 19 (3), 298-318 (1994).
- Garcia-Rill, E., Simon, C., Smith, K., Kezunovic, N., Hyde, J. The pedunculopontine tegmental nucleus: from basic neuroscience to neurosurgical applications: arousal from slices to humans: implications for DBS. J. Neural. Transm. 118 (10), 1397-1407 (2011).
- Mazzone, P., et al. Implantation of human pedunculopontine nucleus: a safe and clinically relevant target in Parkinson's disease. Neuroreport. 16 (17), 1877-1881 (2005).
- Simon, C., et al. Gamma band unit activity and population responses in the pedunculopontine nucleus. J. Neurophysiol. 104 (1), 463-474 (2010).
- Kezunovic, N., Urbano, F. J., Simon, C., Hyde, J., Smith, K., Garcia-Rill, E. Mechanism behind gamma band activity in pedunculopontine nucleus (PPN). Eur. J. Neurosci. 34 (3), 404-415 (2011).
- Hyde, J. R., Kezunovic, N., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. Spatiotemporal properties of high speed calcium oscillations in the pedunculopontine nucleus. J. Appl. Physiol (1985). 115 (9), 1402-1414 (2013).
- Llinas, R. R., Leznik, E., Urbano, F. J. Temporal binding via cortical coincidence detection of specific and nonspecific thalamocortical inputs: a voltage-dependent dye-imaging study in mouse brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (1), 449-454 (2002).
- Boucetta, S., Cisse, Y., Mainville, L., Morales, M., Jones, B. E. Discharge profiles across the sleep-waking cycle of identified cholinergic, gabaergic, and glutamatergic neurons in the pontomesencephalic tegmentum of the rat. J. Neurosci. 34 (13), 4708-4727 (2014).
- Datta, S., Siwek, D. F. Single cell activity patterns of pedunculopontine tegmentum neurons across the sleep-wake cycle in the freely moving rats. J. Neurosci. Res. 70 (4), 79-82 (2002).
- Datta, S., Siwek, D. F., Stack, E. C. Identification of cholinergic and non-cholinergic neurons in the pons expressing phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein as a function of rapid eye movement sleep. Neuroscience. 163 (1), 397-414 (2009).
- Kayama, Y., Ohta, M., Jodo, E. Firing of 'possibly' cholinergic neurons in the rat laterodorsal tegmental nucleus during sleep and wakefulness. Brain Res. 569 (2), 210-220 (1992).
- Sakai, K., El Mansari, M., Jouvet, M. Inhibition by carbachol microinjections of presumptive cholinergic PGO-on neurons in freely moving cats. Brain Res. 527 (2), 213-223 (1990).
- Lindsley, D. B., Bowden, J. W., Magoun, H. W. Effect upon the EEG of acute injury to the brainstem activating system. Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 475-486 (1949).
- Moruzzi, G.
- Moruzzi, G., Magoun, H. W. Brain stem reticular formation and activation of the EEG. Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 455-473 (1949).
- Steriade, M., Constantinescu, E., Apostol, V. Correlations between alterations of the cortical transaminase activity and EEG patterns of sleep and wakefulness induced by brainstem transections. Brain Res. 13 (1), 177-180 (1969).
- Ishibashi, M., et al. Orexin receptor activation generates gamma band input to cholinergic and serotonergic arousal system neurons and drives an intrinsic Ca2+ -dependent resonance in LDT and PPT cholinergic neurons. Frontiers Neurol. 6, e120 (2015).
- Brown, R. E., Winston, S., Basheer, R., Thakkar, M. M., McCarley, R. W. Electrophysiological characterization of neurons in the dorsolateral pontine REM sleep induction zone of the rat: intrinsic membrane properties and responses to carbachol and orexins. Neuroscience. 143 (3), 739-755 (2006).
- Goetz, L., et al. On the role of the pedunculopontine nucleus and mesencephalic reticular formation in locomotion in non-human primates. J. Neurosci. 36 (18), 4917-4929 (2016).
- Fraix, V., et al. Pedunculopontine nucleus area oscillations during stance, stepping and freezing in Parkinson's disease. PLOS ONE. 8 (12), e83919 (2013).
- Luster, B., Hyde, J., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. Mechanisms behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN). Abstr Soc Neurosci. 38, 257.20 (2014).
- Luster, B., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. High-threshold Ca2+ channels behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN). Physiol. Rep. 3 (6), e12431 (2015).
