Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Published: November 23, 2016 doi: 10.3791/54692
Automatic Translation
1, 2, 2
1Plant Gene Expression Center, Agricultural Research Service, USDA, 2Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

Protocol

ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، ونحن ركزت على معايرة التردد stromule في البشرة من N. يترك benthamiana. وقد تم إنشاء العديد من خطوط المعدلة وراثيا مستقرة والتي يمكن استخدامها لهذا الغرض، بما في ذلك 35S المحترفين: FNRtp: EGFP 13 و NRIP1: فندق Cerulean 6. كل من هذه الخطوط تظهر التعبير القوي من fluorophores في سدى بلاستيدات الخضراء من الأوراق نمت في ظل مجموعة واسعة من الظروف. بدلا من ذلك، fluorophores المستهدفة بلاستيدات الخضراء ويمكن التعبير عن عابر في N. benthamiana باستخدام الأجرعية التحولات 13. وهذا هو أقل مثالية من خطوط المعدلة وراثيا، منذ تسلل الأجرعية تحفز بعض الردود الدفاع القاعدية في N. benthamiana والتفاعل مع الأجرعية يمكن أن يغير تردد stromule في ورقة 14، ويحتمل أن تعقيد تفسير النتائج. وأخيرا، لتصور تشكيل stromule في المختبر،يمكن استخراجها البلاستيدات الخضراء من أي من الأنواع النباتية، وذلك باستخدام إما fluorophores المرمزة وراثيا أو صبغة الفلورسنت، كما هو موضح في المادة 5 أدناه. 9،15

ملاحظة: طرق تفصيلية لزراعة النباتات وقد وصفت سابقا 16 لفترة وجيزة، وتنمو N. النباتات benthamiana في 4 "قدور مليئة أي مزيج التربة المهنية التي توفر الصرف الجيد. تغطية الشتلات مع قبة من البلاستيك واضحة ل14/10 الأيام الأولى لتوفير بيئة رطبة للإنبات. إضافة أي مزيج الأسمدة القياسية التالية تعليمات الشركة الصانعة إلى 14- النباتات يوما من العمر. نباتات تنمو في ظل الضوء الأبيض، وذلك باستخدام ~ 100 مكرومول الفوتونات م -2 ثانية -1 شدة الضوء. محطات المياه بشكل منتظم.

1. إعداد العينات ورقة عن التصور

تتأثر ديناميات Stromule التي كتبها جرح 8، لذلك ينبغي إجراء إعداد الأنسجة مباشرة قبل تصور stromule ملاحظة:الصورة بواسطة المجهر مضان متحد البؤر. من الناحية المثالية، ينبغي تصور عينة مع 15 دقيقة بعد إزالة من المصنع.

  1. قطع جزء صغير من ورقة باستخدام شفرة حلاقة حادة جدا. دائما استخدام نفس المنطقة من ورقة من أجل التناسق، وتكون على يقين من أن تصور نفس السطح (متجه نحو المحور أو مجافي المحور) في جميع التجارب.
  2. مباشرة بعد قطع الجزء رقة، وغمر قسم ورقة في 5 مل حقنة needleless مملوءة بالماء، وإزالة الهواء من الحقنة، وتطبيق الفراغ الذي يغطي فتحة المحاقن مع إصبع وسحب المكبس.
    1. الافراج عن الغطاس بلطف لتجنب إتلاف القسم ورقة. كرر هذا مرتين أو ثلاث مرات، أو حتى أكثر من الهواء تمت إزالة ورقة ويبدو أن الأخضر العميق.
      ملاحظة: هذه الخطوة يزيل الهواء في ورقة التي يمكن أن تتداخل مع التصور الدقيق لstromules.
  3. إضافة قطرة ماء إلى شريحة ووضع القسم ورقة على هذا الانخفاض. ثم، تضاف الدكتور آخرالمرجع من الماء إلى أعلى ورقة، ووضع زلة غطاء على ورقة. إذا كان هناك أي فقاعات الهواء، اضغط بلطف انزلاق الغطاء حتى تتم إزالتها. الشريحة الآن جاهزة للفحص المجهري، وينبغي تصور فورا.

2. تصور Stromules مع متحد البؤر مضان المجهر

  1. مع الضوء المرسل، والتركيز على مجال الرؤية بالقرب من مركز للقسم ورقة (بعيدا عن الخلايا التالفة بواسطة شفرة الحلاقة). استخدام هدفا 20X حتى أن العديد من البلاستيدات الخضراء يمكن تصور في وقت واحد. حفظ صورة مع الضوء المرسل بحيث أنواع الخلايا يمكن تمييزها في وقت لاحق، إذا لزم الأمر.
  2. التبديل مصدر إضاءة ليزر مع الإثارة وانبعاث المرشحات المناسبة لfluorophore المستخدمة. على سبيل المثال، تثير GFP مع ليزر 488 نانومتر، وجمع الانبعاثات بين 500 نانومتر و 525 نانومتر.
    1. باستخدام برنامج المجهر، حدد القناة GFP وانقر لضبط فتحة الثقب إلى 1 منظمة العفو الدوليةوحدة راي. حدد المسح الضوئي ليزر، لبدء تصور العينة، ومن ثم انقر فوق القناة GFP لضبط كثافة الليزر وكسب كاشف لتقليل قوة الليزر في حين لا تزال تصور بوضوح stromules. مرة واحدة وقد تم تحديد هذه الإعدادات، والاحتفاظ بها متسقة قدر الإمكان في جميع التجارب.
  3. إعداد التجربة -stack ض من شأنها أن جمع سلسلة من الصور من خلال البشرة ورقة في مجال الرؤية.
    1. لض -stack، وتشمل جميع البلاستيدات الخضراء البشرة في مجال الرؤية لتجنب التحيز (على سبيل المثال، إذا البلاستيدات الخضراء بالقرب من سطح الورقة لديها أكثر stromules في ظل ظروف اختبار).
    2. التقاط صور في أقصى فترة ممكنة من شأنها أن تشمل جميع stromules لكن تقليل الوقت اللازم لض -stack. على سبيل المثال، إذا 1 وحدة إيري ما يعادل قسم متحد البؤر في التركيز الذي هو 2 ميكرون عميقة، مع صورة كل 2 ميكرون من المرجح مثالية.
      ملاحظة: epidermi ورقةالصورة هو سطح غير مستو، وبالتالي فإن عمق إجمالي قدره ض -stack سوف تختلف تبعا للعينة. سيتطلب أكثر -stacks ض 10-20 الصور، ولكنها قد تشمل أكثر من ذلك.
    3. ضبط سرعة المسح الضوئي ودقة وضوح الصورة عند الضرورة للتأكد من أن ض -stack يتم جمعها بسرعة (عادة في غضون 5-10 دقيقة، إذا كان ذلك ممكنا). حفظ ض -stack لتحليلها لاحقا.

تجهيز 3. صورة

  1. تحديد تردد stromule باستخدام أي برنامج تحليل الصور. لهذا البروتوكول، ونحن نوصي باستخدام يماغيج، وهي متاحة للجمهور من المعاهد الوطنية للصحة (http://imagej.nih.gov/ij/)، أو الترقية شعبية من يماغيج، فيجي (http://fiji.sc / فيجي).
  2. دمج ض -stack في صورة واحدة باستخدام الحد الأقصى لإسقاط كثافة في البرنامج.
  3. تحديد ويدويا عد كل البلاستيدات الخضراء في الصورة.
  4. لكل بلاستيدات الخضراء، بصريا تحديد ما إذا كان واحد أو أكثر stromulesوينظر تمتد من بلاستيدات الخضراء في صورة ض المدمجة -stack. فعلى سبيل المثال، انظر الشكل 1.
    ملاحظة: منذ ليست معروفة على الوظائف البيولوجية من stromules، أي رقيقة، مليئة سدى، تمديد أنبوبي من بلاستيدات الخضراء يمكن اعتباره "stromule"، بغض النظر عن طول. كقاعدة عامة، على تمديد مليئة سدى من بلاستيدات الخضراء هو stromule إذا كان أقل من حوالي 1 ميكرون في القطر على طول أكثر من طوله 7. تأكد من أن شخص واحد يحلل جميع الصور للسيطرة على الاختلافات الموضوعية في تحديد ما إذا كان أو لم يكن لديها بلاستيدات الخضراء stromule. باحث الثاني يجب التحقق بشكل مستقل الترددات stromule لزيادة خفض التحيز الذاتية.

4. تصميم التجارب وأخذ العينات

ملاحظة: Stromule تردد متغير بدرجة كبيرة بين الأوراق، ولكن تشير العديد من التقارير أن هناك اختلاف بسيط في وتيرة stromule ضمن indiviالمزدوج ورقة 9،17.

  1. حساب التردد ورقة stromule من حقل واحد من عرض من ورقة واحدة. تجاهل ورقة، والنظر في هذه عينة مستقلة. لا تنظر في حقول منفصلة من وجهة نظر من ورقة واحدة كعينات مستقلة.
    ملاحظة: ليس هناك إجماع قوي حول أفضل الطرق لقياس التغيرات في النشاط stromule، وحتى يتم تعريف وظيفة من stromules أكثر وضوحا، يجب على الباحثين الاستمرار في الإبداع في قياس ديناميكية stromule. وعلى سبيل المقارنة عبر الأدب، ومع ذلك، معايير مشتركة للإبلاغ ينبغي أن تستخدم بالإضافة إلى أكثر الأساليب الإبداعية. كحد أدنى، ودائما يقدم وتيرة البلاستيدات الخضراء التي لديها واحد أو أكثر stromules.
  2. تحديد وتيرة البلاستيدات الخضراء التي لديها stromules في مجال الرؤية. استخدام يماغيج لتحديد جميع البلاستيدات الخضراء في مجال الرؤية. ثم، لكل بلاستيدات الخضراء، وتحديد ما إذا كان بلاستيدات الخضراء شكلت stromule واحد على الأقل. تقرير تردد stromule كما percentaجنرال الكتريك من البلاستيدات الخضراء مع stromule.
    ملاحظة: بعض الباحثين تحويل النسبة المئوية، على سبيل المثال مع تحول قوس جيب الزاوية، قبل إبلاغ الترددات stromule. في حين أن هذا هو خيار للتحليل الإحصائي، وقوس جيب الزاوية تردد stromule ليس قيمة بديهية، وليس من الضروري أن يكون ورد في النص الرئيسي أو شخصيات من الدراسة.
    1. كنهج بديل، نحصي عدد من stromules، ونقسمه على عدد من البلاستيدات الخضراء.
      ملاحظة: في معظم الحالات، وهذا سوف تسفر عن نتائج مماثلة لنهج 4.2. قد نبالغ في تقدير تردد stromule، ومع ذلك، إذا كان بلاستيدات الخضراء واحدة شكلت العديد stromules. في المثال الموضح تحت نتائج ممثل، على سبيل المثال، العديد من البلاستيدات الخضراء واثنين أو أكثر stromules، ليرتفع بذلك عدد stromules في بلاستيدات الخضراء إلى 40/87 (مقابل تردد stromule من 33/87).
    2. بدلا من ذلك، تحديد طول stromule بدلا من التردد stromule. ويمكن قياس طولفي ImageJ عن طريق تتبع stromule مع أداة سطر مرفوعة.
      ملاحظة: بما أن الدور البيولوجي للstromules لا يزال غير معروف، فإنه ليس من الواضح أن طول stromule يؤثر على وظيفتها. عن اختلافات كبيرة في طول stromule إذا لوحظ أنها، ولكن أيضا الإبلاغ عن الترددات stromule (كما هو موضح في 4.2).
      ملاحظة: تردد Stromule يمكن أن يكون متغير بدرجة كبيرة بين أوراق مختلفة تحت ظروف النمو نفسها. لذلك، على الرغم من تحديد تردد stromule يمكن أن يكون مضيعة للوقت، وينبغي تصميم التجارب بعناية لتشمل عينات كبيرة الحجم. استخدام قواعد البيانات من مختبرنا، توصلنا إلى أن حجم عينة من 16 شخصا على الأقل نباتات كل معاملة عادة ما يكون قويا بما فيه الكفاية لتحديد ما إذا كان هناك فروق ذات دلالة إحصائية تغيير 1.5 أضعاف على الأقل في وتيرة stromule بين شرطين (مع معيار α = 0.05 و β = 0.80).
  3. التحليل الإحصائي للنتائج.
    1. مقارنة ليعلى ترددات stromule من اثنين من العلاجات، واستخدام اختبار ر ولش (المعروف أيضا باسم heteroscedastic اختبار تي أو تي اختبار افتراض التباين عدم المساواة).
      ملاحظة: هذه التجربة ليست قوية مثل اختبار ر الطالب التقليدي، ولكن اختبار ر ولش هو مفيد لأنه لا نفترض أن التباين في توزيع الترددات stromule مشابه بين العلاجات.
      ملاحظة: بما تردد stromule هو "نسبة"، ومن المتوقع توزيع المعاينة لتكون ذات الحدين بدلا من وضعها الطبيعي، والتي يمكن أن التحليل الإحصائي الانحراف نظريا إذا أحجام عينة منخفضة جدا أو إذا كان تردد stromule منخفض جدا (قريبة من 0٪) أو جدا عالية (ما يقرب من 100٪). وقد استخدمت بعض التقارير التحولات قوس جيب الزاوية قبل التحليل الإحصائي، الذي يهدف إلى تحويل توزيع ذي الحدين إلى التوزيع الطبيعي، وبالتالي تلبية المتطلبات القياسية لاختبار ر الطالب أو ANOVA. في الممارسة العملية، ومع ذلك،التحولات rcsine يكون لها أثر يذكر أو لا على التحليل الإحصائي، وبالتالي فهي ليست الموصى بها. بدلا من ذلك، تكرار تجارب لزيادة حجم العينة، والتي سوف تزيد القدرة الإحصائية وتقليل الأخطاء في تفسير البيانات.
    2. وأيا كان النهج الإحصائية واستخدامها، ومما لا شك فيه أن يقدم بعناية استراتيجية أخذ العينات، وحجم العينة، واختبار إحصائي، وقيمة احتمالية لكل تجربة.
      ملاحظة: كما هو الحال مع مجالات أخرى من مجالات علم الأحياء، يمكن النظر في قيمة احتمالية أقل من 0.05 "ذات دلالة إحصائية"، على الرغم من أن الباحثين بالتأكيد بالإبلاغ عن قيمة ص الدقيقة التي حصل عليها. إذا ص هو أعلى قليلا من 0.05، وزيادة حجم العينة مع اثنين أو ثلاث تجارب قد تساعد في توضيح ما إذا كان أو لم يكن الفرق الذي لوحظ هو تكرار للوذات دلالة إحصائية.

5. استخراج البلاستيدات الخضراء سليمة لتصور Stromule حيوية

ملاحظة: عدة طرقوقد استخدمت لعزل البلاستيدات الخضراء من الأوراق، بما في ذلك بروتوكول مختلف قليلا في دراسة حديثة حول تشكيل stromule في المختبر 15. بروتوكول المفصلة أدناه يستخدم طريقة بسيطة نسبيا والتي لا تسفر عينات بلاستيدات الخضراء النقية كيميائيا، ولكنه بدلا من ذلك عزل كمية كبيرة من سليمة، البلاستيدات الخضراء صحية 9،18.

  1. إعداد البارد استخراج العازلة: 50 ملي HEPES هيدروكسيد الصوديوم، 330 ملي السوربيتول، 2 ملي EDTA، 1.0 ملي MgCl 2، و 1.0 ملي MnCl 2. ضبط درجة الحموضة إلى 6.9 مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك، وبردت قبل الاستخدام.
    ملاحظة: على الرغم من أن ليس من الضروري، وذلك باستخدام مخازن التبريد وحفظ العينات على الجليد عندما يكون ذلك ممكنا سيحقق نسبة أعلى من البلاستيدات الخضراء سليمة.
  2. إعداد عازلة العزلة: 50 ملي HEPES هيدروكسيد الصوديوم، 330 ملي السوربيتول، 2 ملي EDTA، 1.0 ملي MnCl 2، 1.0 ملي MgCl 2 و 10 ملي بوكل، و 1.0 ملي مول كلوريد الصوديوم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.6 مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك وبردت قبل الاستخدام.
  3. إذا كانت الأوراق ليستمعربا عن fluorophore انسجة المشفرة وراثيا، وإعداد ثنائي الأسيتات carboxyfluorescein (CFDA) الحل: 50 ملي CFDA حل الأسهم في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) (CFDA 2.3 ملغ لكل 1.0 مل DMSO).
    ملاحظة: إن التركيز المضبوط ليست حرجة. الحفاظ على المخزون CFDA في الظلام في كل الأوقات. تخزين قسامات صغيرة من 50 ملي CFDA في -20 درجة مئوية.
  4. لعزل البلاستيدات الخضراء، وإزالة ~ 5-10 أوراق ز من عدة مصانع وشطف لفترة وجيزة في الماء البارد. ونقل على الفور إلى 50 مل العازلة استخراج الباردة. أوراق طحن باستخدام الخلاط مع العديد من نبضات قصيرة. من خلال تصفية اثنين أو ثلاث طبقات من القماش القطني لإزالة الأنقاض ورقة، وتقسيم البلاستيدات الخضراء استخراج الى قسمين 50 مل أنابيب الطرد المركزي، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة على 750 ز س.
  5. تجاهل طاف و resuspend البلاستيدات الخضراء الخضراء في المخزن عزل 10 مل. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 1 دقيقة في 750 x ج، ونبذ طاف، والبلاستيدات الخضراء resuspend في عازلة العزلة لجلب الحجم النهائي إلى 5 مل.
  6. نقل 201؛ لتر من البلاستيدات الخضراء إلى شريحة، وتغطي مع ساترة، ويبدأ الفحص المجهري.
    ملاحظة: البلاستيدات الخضراء من النباتات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية المستهدفة صانعة جاهزة الآن لتصور بواسطة المجهر مضان متحد البؤر.
  7. وصمة عار البلاستيدات الخضراء من النباتات التي لا يتم التعبير عن البروتينات الفلورية المستهدفة صانعة لتصور stromules.
    1. إضافة 5 ميكرولتر من 50 ملي الأسهم CFDA إلى 5 مل البلاستيدات الخضراء مع وقف التنفيذ في المخزن العزلة. جلب التركيز النهائي إلى 50 ميكرومتر.
    2. السماح البلاستيدات الخضراء لاحتضان لمدة 5 دقائق، ثم نقل قسامة صغيرة (~ 50 ميكرولتر) إلى شريحة، وتغطي مع ساترة، ويبدأ الفحص المجهري.
    3. استخدام مجموعة فلتر FITC أو GFP. استخدام هدفا 20X إلى تصور العديد من البلاستيدات الخضراء في وقت واحد، أو الهدف الأسمى لتصور بلاستيدات الخضراء المعزولة واحدة.
      ملاحظة: سوف CFDA يتألق داخل سدى من البلاستيدات الخضراء سليمة.
    4. إذا كان هناك مضان خلفية قوية، وغسل chloroplasts مرة أخرى في 10 مل العازلة العزلة بعد الحضانة مدة 5 دقائق مع CFDA، الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 750 x ج، تجاهل طاف، و resuspend العازلة في عزلة 5 مل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدم هذا البروتوكول لتصور تردد stromule في النهار والليل في النبتات من N. الشباب الشتلات benthamiana. تم دمج شرائح من كومة Z- في صورة واحدة (الشكل 1A). لأغراض البصرية، كانت تلك الصورة ثم غير المشبعة ومقلوب بحيث يظهر سدى الأسود (الشكل 1B). وصفت البلاستيدات الخضراء إما عدم وجود stromules (النجمة الخضراء) أو وجود stromule واحد على الأقل (أرجواني النجمة). من البلاستيدات الخضراء البشرة 87 تصور، 33 ديهم stromules. وهكذا، فإن تردد stromule في هذه الورقة هو 37.9٪.

باستخدام هذا التحليل، وتكرر البروتوكول لمدة 21 محطات أخرى (ورقة واحدة للنبات) خلال النهار، وما مجموعه 24 محطات في الليل. في هذا اليوم، كان متوسط ​​تردد stromule 20.8 ± 1.8٪، في الليل، كان متوسط تردد stromule 12.8 ± 0.9٪ (الشكل2). وكان تردد Stromule أعلى بكثير خلال النهار، على النحو الذي يحدده اختبار ر ولش (ن ≥ 22، ص <0.0005). لاحظ أنه على الرغم من أن أكثر من 23،000 البلاستيدات الخضراء وعدة مئات من الخلايا لوحظت، وحجم العينة، ن، وكما ذكرت 22، فحص عدد من محطات مستقلة.

باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا، وقد لوحظت stromules بلاستيدات الخضراء في المختبر بعد عزلة من أوراق N. benthamiana معربا عن استهداف صانعة GFP (الشكل 3A)، أو بعد استخدام CFDA وصمة عار البلاستيدات الخضراء المعزولة من N. benthamiana (الشكل 3B) أو Spinacia OLERACEA (الشكل 3C).

شكل 1
الشكل 1. تحديد مقدار التردد stromule في N. benthأوراق amiana. (A) A Z -stack من حقل جزئي نظر البشرة من N. تم دمج benthamiana معربا عن انسجة GFP لإظهار كل البلاستيدات الخضراء البشرة وstromules في صورة واحدة. (ب) تم تحويل هذه الصورة إلى الأبيض والأسود ومقلوب لأغراض البصرية. يشار إلى البلاستيدات الخضراء مع stromules من قبل النجمة أرجواني. يشار إلى البلاستيدات الخضراء دون stromules من قبل النجمة الخضراء. تمثل الحانات نطاق 10 ميكرون. تعديل من Brunkard وآخرون. 9 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. مقارنة تردد stromule عبر الظروف. وقد استخدم هذا البروتوكول لتحديد شارعتردد omule في 22 مصنعا في اليوم و 24 محطات في الليل. وكان تردد Stromule أعلى بكثير خلال النهار من الليل (اختبار ر ولش، ن ≥ 22، ص <0.0005). أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري. تعديل من Brunkard وآخرون. 9 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تصور stromules بعد استخراج البلاستيدات الخضراء سليمة من الأوراق. (A) البلاستيدات الخضراء من N. المعدلة وراثيا benthamiana يترك GFP أعرب (الأخضر) التي تستهدف تم عزل باستخدام البروتوكولات المذكورة هنا بلاستيدات الخضراء. تم عزل (ب) البلاستيدات الخضراء من النوع البري N. benthamiana أوراق وملطخة CFDA، التي فلووresces فقط داخل سليمة، البلاستيدات الخضراء قابلة للحياة (كما هو موضح باللون الأصفر). (C) البلاستيدات الخضراء ويمكن أيضا أن تكون معزولة من الأنواع النباتية الأخرى، مثل السبانخ (س. OLERACEA)، ومن ثم ملطخة CFDA (الصفراء). ويرد الكلوروفيل تألق ذاتي باللون الأحمر. تعديل من Brunkard وآخرون. 9

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عند التحقيق stromules، يجب النظر في ثلاثة عوامل هامة من خلال: (أ) التلاعب في الأنسجة النباتية يجب أن تبقى إلى أدنى حد ممكن، (ب) يجب أن يبقى النظام التجريبي متسقة، و (ج) استراتيجيات أخذ العينات يجب أن يتم التخطيط بعناية ل ضمان قوية، ويتم تحليل البيانات استنساخه.

Stromules دينامية ملحوظة: يمكن أن يمتد ويتقلص بسرعة أمام عينيه مراقب تحت المجهر. وعلاوة على ذلك، تردد stromule يختلف اختلافا كبيرا في استجابة لمجموعة واسعة من العلاجات، بما في ذلك المثيرات التي لا يمكن تجنبها من أجل رؤية stromules (مثل جرح ورقة). الحل الأساسي لهذه المشكلة التي تناولها مع البروتوكولات المذكورة هنا، هو لإجراء التجارب التي تسيطر عليها بشكل جيد، وحفظ جميع المتغيرات ثابتة. وهذا يشمل، على سبيل المثال، وإعداد كل عينة لرؤية مباشرة قبل الوصول بها إلى المجهر. لا ينبغي أن يكون معطوبا النباتاتحتى قبيل التصور. الحل الثاني لهذه المشكلة هو تقليل تعقيد البروتوكولات: من الناحية المثالية، ينبغي تطبيق أي علاج مباشرة إلى محطة دون إزالة ورقة أو التسبب في أي ضرر.

وقد تم دراسة Stromules في مجموعة مذهلة من الأنواع وأنواع الخلايا، بما في ذلك الشعر القمح الجذر، ثمار الطماطم، وشتلات التبغ etiolated 8،19. هذه الدراسات الرائدة تقدمت فهم ديناميات stromule خلال تطوير المصنع وبحثت مجموعة من الأنشطة stromule. مقارنات من هذه النظم التجريبية المختلفة، ومع ذلك، يمكن أن تؤدي إلى تفسيرات خاطئة، حيث يتم تنطوي على أنواع مختلفة من البلاستيدات في العمليات البيولوجية المختلفة إلى حد كبير.

على سبيل المثال، البلاستيدات الخضراء تجعل stromules ردا على الاكسدة الناجمة عن سلسلة الإلكترون الضوئي، ولكن منذ بلاستيدات عديمة اللون تفتقر إلى آلية التمثيل الضوئي، فهي ليست حساسة لنفس المحفزات 9. يمكن استخدام أي نظام تجريبي للتحقيق stromules، ولكن يجب أن تبقى على نظام تجريبي ثابت طوال فترة الدراسة إن وجدت المقارنات التي يمكن استخلاصها. العوامل في الاعتبار تشمل الأنواع، ونوع من الخلايا، ومرحلة النمو أو عمر النبات، وطريقة stromules تلطيخ (سواء من خلال التعبير مستقرة التحوير والتعبير التحوير عابرة، أو fluorophore خارجي)؛ حتى تكون هناك اختلافات طفيفة من هذه العوامل يمكن أن يربك تفسير لاحق من النتائج.

وأخيرا، فإن أي دراسة البيولوجيا stromule يجب استخدام استراتيجية قوية أخذ العينات يمكن الاعتماد عليها للتأكد من أن النتائج استنساخه وذات الصلة من الناحية البيولوجية. أخذ العينات مرارا وتكرارا من مصنع واحد، على سبيل المثال، التقاط الصور من عدة مناطق من ورقة واحدة، وعلى ما يبدو تحسين القدرة الإحصائية، لكن يمكن أن يكون مضللا. كما هو مبين في بيانات تمثيلية أعلاه، تردد stromule من ورقة واحدة قد تختلف بشكل كبير من وتيرة stromule متوسطعبر العديد من الأوراق: في تلك الورقة، التي كانت تصور أثناء النهار، وجعلت 37.9٪ من البلاستيدات الخضراء stromules، على الرغم من أن وتيرة stromule نفسه عبر الأوراق أثناء النهار وكان ما يقرب من نصف ذلك، فقط 20.8٪.

وعلاوة على ذلك، نظرا لمدى لا يعرف الكثير عن ديناميات stromule في هذا الوقت، أي تجربة يجب أن تتكرر تماما ثلاث مرات على الأقل، وأكثر من ذلك إن أمكن، لضمان أن متغيرات غير متوقعة ليست مسؤولة عن أي تغيرات في النشاط stromule التي يتم ملاحظتها. قبل كل شيء، منذ مجال stromule البيولوجيا هو مجرد بداية للاقلاع، يجب على الباحثين أن توثق بعناية وتفيد جميع جوانب التصميم التجريبي، بما في ذلك الانحرافات الإبداعية من بروتوكول بسيط المذكورة هنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hepes Sigma-Aldrich H3375
NaOH Fischer-Scientific S320-1
Sorbitol Sigma-Aldrich S1876
EDTA Fischer-Biotech BP121
MnCl2 Sigma-Aldrich 221279
MgCl2 Sigma-Aldrich M0250
KCl Sigma-Aldrich P3911
NaCl Sigma-Aldrich S9625
Laser Scanning Confocal Microscope  Carl Zeiss Inc Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) Sigma-Aldrich 21879 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) EMD MX1458-6
Waring blender Waring  Model: 31BL92
Fiji fiji.sc Open-source software for analyzing biological images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
  2. Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).
  3. Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata. Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).
  4. Nomura, H., et al. Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis. Nat. Commun. 3, 926 (2012).
  5. Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).
  6. Caplan, J. L., et al. Chloroplast stromules runction during innate immunity. Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).
  7. Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function. Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).
  8. Gray, J. C., et al. Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid. Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).
  9. Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).
  10. Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants. Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).
  11. Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis. Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).
  12. Chiang, Y. -H., et al. Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis. Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).
  13. Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics. Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).
  14. Erickson, J. L., et al. Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays. BMC Plant Biol. 14 (1), 127 (2014).
  15. Ho, J., Theg, S. M. The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana. PLoS One. 11 (2), e0146489 (2016).
  16. Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).
  17. Schattat, M. H., Klösgen, R. B. Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 11, 115 (2011).
  18. Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).
  19. Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell. Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).

Tags

علم الأحياء النباتية، العدد 117، stromules، البلاستيدات الخضراء، بلاستيدات عديمة اللون، البلاستيدات، الأكسدة إشارات، إشارات الخلية، بيولوجيا الخلية النباتية
تصور التردد Stromule مع مضان المجهر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brunkard, J. O., Runkel, A. M.,… More

Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (117), e54692, doi:10.3791/54692 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter