Protocol
NOTE: Pour ce protocole, nous avons mis l' accent sur le dosage de la fréquence stromule dans l'épiderme de N. benthamiana laisse. Plusieurs lignées transgéniques stables ont été générés qui peuvent être utilisés à cette fin, y compris 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 et NRIP1: Cerulean 6. Ces deux lignées montrent une expression robuste de fluorophores dans le stroma des chloroplastes des feuilles cultivées dans un large éventail de conditions. Alternativement, fluorophores chloroplastiques ciblées peuvent être transitoirement exprimés en N. benthamiana en utilisant Agrobacterium transformations 13. Ceci est moins idéal que les lignées transgéniques, car les infiltrations d'Agrobacterium induisent des réponses de défense de base dans N. benthamiana et les interactions avec Agrobacterium peuvent modifier la fréquence stromule dans la feuille 14, ce qui pourrait compliquer l' interprétation des résultats. Enfin, pour visualiser la formation stromule in vitro,chloroplastes peuvent être extraits de toutes les espèces de plantes, en utilisant soit des fluorophores codés génétiquement ou un colorant fluorescent, tel que décrit dans la section 5 ci - dessous. 9,15
NOTE:. Méthodes détaillées pour la culture des plantes ont été décrites précédemment 16 Brièvement, grandir N. plantes benthamiana en 4 pots "remplis de tout mélange de sol professionnel qui fournit un bon drainage. Couvrir les semis avec un dôme en plastique transparent pour les 10-14 premiers jours pour fournir un environnement humide pour la germination. Ajouter un mix d'engrais standard suivant les instructions du fabricant à 14- day-old plantes. Cultiver les plantes sous une lumière blanche, en utilisant ~ 100 pmol photons m -2 s -1 intensité de la lumière. les plantes aquatiques régulièrement.
1. Préparation des échantillons de feuilles pour la visualisation
NOTE: la dynamique de Stromule sont affectés par blessant 8, de sorte que la préparation des tissus doit être effectuée immédiatement avant la visualisation stromules par microscopie à fluorescence confocale. Idéalement, un échantillon doit être visualisé avec 15 min après le retrait de la plante.
- Couper une petite section de la feuille en utilisant une lame de rasoir très forte. Toujours utiliser la même région de la feuille pour la cohérence, et être certain de visualiser la même surface (adaxial ou abaxial) dans toutes les expériences.
- Immédiatement après la découpe de la section de la feuille, immerger le tronçon de feuille dans une seringue sans aiguille 5 ml remplie d'eau, retirer l'air de la seringue, et d'appliquer un vide, en recouvrant l'orifice de la seringue avec un doigt et en tirant le piston.
- Relâchez le piston doucement pour éviter d'endommager la section de la feuille. Répétez cette opération deux ou trois fois, ou jusqu'à ce que la majeure partie de l'air a été retiré et la feuille semble être vert foncé.
REMARQUE: Cette étape enlève l'air dans la feuille qui peut interférer avec la visualisation précise de stromules.
- Relâchez le piston doucement pour éviter d'endommager la section de la feuille. Répétez cette opération deux ou trois fois, ou jusqu'à ce que la majeure partie de l'air a été retiré et la feuille semble être vert foncé.
- Ajouter une goutte d'eau sur une lame et placez la section de feuille sur cette baisse. Ensuite, ajoutez une autre drop de l'eau vers le haut de la feuille, et placer une lamelle sur la feuille. S'il y a des bulles d'air, tapotez doucement la lamelle jusqu'à ce qu'ils soient retirés. La diapositive est maintenant prêt pour la microscopie, et doit être visualisé immédiatement.
2. Visualizing Stromules avec confocale Microscopie Fluorescence
- Avec la lumière transmise, se concentrer sur un champ de vision à proximité du centre de la section de feuille (loin des cellules endommagées par la lame de rasoir). Utilisez un objectif 20X de sorte que de nombreux chloroplastes peuvent être visualisées simultanément. Enregistrer une image avec la lumière transmise de telle sorte que les types de cellules peuvent être distingués plus tard, si nécessaire.
- Commuter la source d'éclairage à un laser avec des filtres d'excitation et d'émission appropriés pour le fluorophore utilisé. Par exemple, exciter la GFP avec un laser 488 nm, et de recueillir des émissions entre 500 nm et 525 nm.
- En utilisant le logiciel du microscope, sélectionner le canal de la GFP et cliquez pour régler l'ouverture sténopé à 1 Aiunité de ry. Sélectionnez balayage laser, pour commencer à visualiser l'échantillon, puis cliquez sur le canal de GFP pour ajuster l'intensité du laser et le gain du détecteur afin de minimiser la puissance du laser tout en visualisant clairement stromules. Une fois que ces paramètres ont été déterminés, les garder aussi cohérente que possible dans toutes les expériences.
- Préparer une expérience -stack z qui permettra de recueillir une série d'images à travers l'épiderme des feuilles dans le champ de vision.
- Pour le -stack z, y compris tous les chloroplastes épidermiques dans le champ de vision pour éviter les biais (par exemple, si les chloroplastes près de la surface des feuilles ont plus stromules dans des conditions testées).
- Prenez des photos à l'intervalle maximum qui comprendra tous les stromules mais réduire au minimum le temps nécessaire pour un z -stack. Par exemple, si 1 unité Airy est équivalente à une section de mise au point confocal qui est de 2 um de profondeur, en prenant une image toutes les 2 um est idéal probable.
NOTE: Le epidermi feuilles est une surface inégale, de sorte que la profondeur totale de la -stack z varie en fonction de l'échantillon; la plupart z -stacks exigeront 10-20 images, mais peuvent inclure plus. - Ajustez la vitesse de balayage et la résolution nécessaire de l' image pour vous assurer que le z -stack est collecté rapidement (généralement dans les 5-10 minutes, si possible). Save the z -stack pour une analyse ultérieure.
Traitement 3. Image
- Déterminer la fréquence stromule en utilisant un logiciel d'analyse d'image. Pour ce protocole, nous vous recommandons d'utiliser ImageJ, qui est accessible au public du National Institutes of Health (http://imagej.nih.gov/ij/), ou la mise à niveau populaire ImageJ, Fidji (http://fiji.sc / Fidji).
- Fusionner le z -stack en une seule image en utilisant la projection d'intensité maximale dans le logiciel.
- Identifier et compter manuellement tous les chloroplastes dans l'image.
- Pour chaque chloroplaste, de déterminer visuellement si un ou plusieurs stromuleson voit l' extension du chloroplaste à l'image de l'axe z fusionnée. Pour des exemples, voir la figure 1.
REMARQUE: Étant donné que les fonctions biologiques de stromules ne sont pas connus, tout mince, stroma-rempli, prolongement tubulaire du chloroplaste peut être considéré comme un "stromule", indépendamment de la longueur. En règle générale, une extension de stroma remplie à partir du chloroplaste est un stromule si elle est inférieure à environ 1 um de diamètre le long de la majeure partie de sa longueur 7. Assurez-vous que une personne analyse toutes les images pour contrôler les différences subjectives pour déterminer si oui ou non un chloroplaste a un stromule. Un second chercheur doit vérifier indépendamment les fréquences de stromule afin de réduire davantage les biais subjectifs.
4. Conception expérimentale et d'échantillonnage
NOTE: Stromule fréquence est très variable entre les feuilles, mais plusieurs rapports suggèrent qu'il ya peu de variation de la fréquence stromule dans un individouble 9,17 feuille.
- Calculer la fréquence feuille stromule d'un seul champ de vision d'une feuille. Jeter la feuille, et considérer cela comme un échantillon indépendant. Ne considérez pas des champs séparés de vue d'une feuille sous forme d'échantillons indépendants.
NOTE: Il n'y a pas un fort consensus sur la façon de meilleurs changements de mesure de l'activité stromule, et jusqu'à ce que la fonction de stromules est plus clairement définie, les chercheurs doivent continuer à faire preuve de créativité dans la quantification de la dynamique de stromule. A titre de comparaison dans la littérature, cependant, des normes communes de reporting devraient être utilisées en plus des approches plus créatives. Au minimum, toujours signaler la fréquence des chloroplastes qui ont un ou plusieurs stromules. - Déterminer la fréquence des chloroplastes ayant stromules dans un champ de vision. ImageJ utiliser pour identifier tous les chloroplastes dans un champ de vision. Ensuite, pour chaque chloroplaste, déterminer si le chloroplaste a formé au moins un stromule. Rapport fréquence stromule comme pourcentage des chloroplastes avec stromule.
REMARQUE: Certains chercheurs transforment le pourcentage, par exemple à la transformation arcsinus, avant de rapporter les fréquences stromule; tout cela est une option pour l'analyse statistique, l'arcsinus de la fréquence stromule est pas une valeur intuitive, et n'a pas besoin d'être signalés dans le texte principal ou les chiffres d'une étude.- Comme une approche alternative, compter le nombre total de stromules, et le diviser par le nombre total de chloroplastes.
REMARQUE: Dans la plupart des cas, cela donnera des résultats similaires à aborder 4.2; il peut surestimer la fréquence de stromule, cependant, si un seul chloroplaste a formé de nombreux stromules. Dans l'exemple illustré dans des résultats représentatifs, par exemple, plusieurs chloroplastes ont deux ou plusieurs stromules, portant le nombre de stromules par chloroplaste à 40/87 (par rapport à une fréquence de stromule du 33/87). - Vous pouvez également déterminer la longueur de stromule au lieu de la fréquence stromule. La longueur peut être mesuréedans ImageJ en traçant le stromule avec l'outil de ligne à main levée.
NOTE: Étant donné que le rôle biologique de stromules reste inconnue, on ne sait pas que la longueur stromule affecte leur fonction. Rapporter des différences significatives dans la longueur stromule si elles sont observées, mais aussi un rapport des fréquences de stromule (comme décrit en 4.2).
REMARQUE: la fréquence Stromule peut être très variable entre les différentes feuilles dans les mêmes conditions de croissance. Par conséquent, bien que la détermination de la fréquence de stromule peut prendre du temps, les expériences doivent être conçues avec soin pour inclure de grandes tailles d'échantillon. Utilisation des ensembles de données de notre laboratoire, nous avons déterminé que la taille de l'échantillon d'au moins 16 plantes pour chaque traitement est habituellement suffisamment puissant pour déterminer s'il y a une différence statistiquement significative d'au moins un changement de 1,5 fois la fréquence stromule entre deux conditions (à la norme α = β = 0,05 et 0,80).
- Comme une approche alternative, compter le nombre total de stromules, et le diviser par le nombre total de chloroplastes.
- L'analyse statistique des résultats.
- Pour comparer le moiune fréquence de stromule de deux traitements, utiliser le test t de Welch (également connu comme le test hétéroscédastiques test t ou t en supposant une variance inégale).
NOTE: Ce test est pas aussi puissant que le test t de Student classique, mais le test t de Welch est avantageuse car elle ne suppose pas que la variance de la distribution de fréquence stromule est similaire entre les traitements.
NOTE: Comme la fréquence stromule est une «proportion», sa distribution d'échantillonnage est prévu pour être binomiale plutôt que la normale, ce qui pourrait l'analyse statistique théoriquement skew si la taille des échantillons est très faible ou si la fréquence stromule est très faible (proche de 0%) ou très élevé (près de 100%). Certains rapports ont utilisé des transformations arcsinus avant l' analyse statistique, qui est destiné à transformer une distribution binomiale à une distribution normale, et ainsi satisfaire aux exigences de la norme de test t ou ANOVA Student. Dans la pratique, toutefois,transformations rcsine ont peu ou pas d'effet sur l'analyse statistique, et ne sont donc pas recommandées. Au lieu de cela, répéter des expériences pour augmenter la taille de l'échantillon, ce qui augmentera la puissance statistique et de réduire les erreurs dans l'interprétation des données. - Quelle que soit l' approche statistique est utilisée, assurez - vous de signaler attentivement la stratégie d'échantillonnage, taille de l' échantillon, test statistique, et la valeur de p pour chaque expérience.
NOTE: Comme avec d' autres domaines de la biologie, une valeur de p inférieure à 0,05 peut être considéré comme «statistiquement significatif», bien que les chercheurs devraient certainement déclarer la valeur de p précise obtenue. Si p est légèrement supérieur à 0,05, ce qui augmente la taille de l' échantillon avec deux ou trois expériences peuvent contribuer à déterminer si oui ou non la différence observée est reproductible et statistiquement significative.
- Pour comparer le moiune fréquence de stromule de deux traitements, utiliser le test t de Welch (également connu comme le test hétéroscédastiques test t ou t en supposant une variance inégale).
5. Extraire chloroplastes intacts pour visualiser les Stromule Dynamics
NOTE: Plusieurs méthodesont été utilisées pour isoler les chloroplastes de feuilles, y compris un protocole légèrement différent dans une étude récente sur la formation stromule in vitro 15. Le protocole décrit ci - dessous utilise une méthode relativement simple qui ne donne pas d' échantillons de chloroplastes biochimiquement pur, mais n'isole la place d' une grande quantité de chloroplastes intacts, sains 9,18.
- Préparer un tampon d'extraction à froid: NaOH 50 mM Hepes, 330 mM de sorbitol, 2 mM d' EDTA, 1,0 mM de MgCl2 et 1,0 mM MnCl 2. Ajuster le pH à 6,9 avec du NaOH et de HCl et mettre au réfrigérateur avant utilisation.
NOTE: Bien que pas nécessaire, en utilisant des tampons froids et de garder des échantillons sur la glace si possible donnera une plus grande proportion de chloroplastes intacts. - Préparer un tampon d'isolement: NaOH 50 mM Hepes, 330 mM de sorbitol, 2 mM d' EDTA, 1,0 mM de MnCl2, 1,0 mM de MgCl2, 10 mM de KCl et 1,0 mM de NaCl. Ajuster le pH à 7,6 avec du NaOH et de HCl et mettre au réfrigérateur avant utilisation.
- Si les feuilles ne sont pasexprimant un fluorophore stromale codé génétiquement, préparer le diacétate de carboxyfluorescéine (CFDA) solution: solution mère mM CFDA 50 dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) (2,3 mg de CFDA par 1,0 ml de DMSO).
REMARQUE: La concentration exacte ne soit pas critique. Gardez CFDA stocks dans l'obscurité à tout moment. Stocker petites portions de mM CFDA 50 à -20 ° C. - Pour isoler les chloroplastes, retirez ~ 5-10 g de feuilles de plusieurs plantes et rincer brièvement à l'eau froide. transférer immédiatement à 50 ml de tampon d'extraction à froid. feuilles Grind en utilisant un mélangeur avec plusieurs impulsions courtes. Filtrer à travers deux ou trois couches de gaze pour éliminer les débris de feuilles, il faut diviser les chloroplastes extraites dans deux tubes de 50 ml de centrifugation et centrifuger pendant 1 min à 750 x g.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les chloroplastes verts dans un tampon d'isolement de 10 ml. Centrifuger pendant 1 min à 750 x g, éliminer le surnageant et les chloroplastes de remettre en suspension dans un tampon d'isolement pour amener le volume final à 5 ml.
- Transfert 201; l des chloroplastes à une lame, couvrir avec une lamelle, et commencer la microscopie.
NOTE: Les chloroplastes de plantes transgéniques exprimant des protéines fluorescentes plaste sont maintenant prêts pour la visualisation par microscopie à fluorescence confocale. - Colorer chloroplastes de plantes qui ne sont pas l'expression de protéines fluorescentes plaste pour visualiser stromules.
- Ajouter 5 ul de 50 mM CFDA actions pour les 5 ml chloroplastes-suspension dans un tampon d'isolement. Amener la concentration finale de 50 uM.
- Autoriser les chloroplastes à incuber pendant 5 min, puis transférer une petite aliquote (~ 50 pi) à une diapositive, couvrir avec une lamelle, et commencent la microscopie.
- Utilisez un jeu de filtres FITC ou GFP. Utilisez un objectif 20X de visualiser de nombreux chloroplastes simultanément, ou un objectif plus élevé pour visualiser un seul chloroplaste isolé.
REMARQUE: CFDA va émettre une fluorescence à l'intérieur du stroma des chloroplastes intacts. - S'il y a une forte fluorescence de fond, laver le chloroplasts à nouveau dans 10 ml de tampon d'isolement après 5 minutes d'incubation avec le CFDA, centrifuger pendant 1 min à 750 x g, Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans 5 ml d'un tampon d'isolement.
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Representative Results
Ce protocole a été utilisé pour visualiser la fréquence stromule à jour et la nuit dans les cotylédons de jeune N. plantules benthamiana. Les tranches d'une pile z- ont été fusionnées en une seule image (figure 1A). Pour les besoins visuels, cette image était alors désaturée et inversée de telle sorte que stroma apparaît en noir (figure 1B). Les chloroplastes ont été marquées soit comme ayant aucun stromules (astérisque vert) ou ayant au moins un stromule (magenta astérisque). Sur les 87 chloroplastes épidermiques visualisées, 33 ont stromules. Ainsi, la fréquence de stromule dans cette feuille est de 37,9%.
Grâce à cette analyse, le protocole a été répété pour 21 autres plantes (une feuille par plante) pendant la journée et un total de 24 plantes dans la nuit. Dans la journée, la fréquence de stromule moyenne était de 20,8 ± 1,8%; la nuit, la fréquence de stromule moyenne était de 12,8 ± 0,9% (Figure2). Stromule fréquence était significativement plus élevée au cours de la journée, tel que déterminé par le test t de Welch (n ≥ 22, p <0,0005). Notez que , bien que plus de 23.000 chloroplastes et plusieurs centaines de cellules ont été observées, la taille de l' échantillon, n, est signalé comme 22, le nombre de plantes indépendantes examiné.
En utilisant le protocole décrit ici, stromules chloroplastes ont été observés in vitro après isolement à partir de feuilles de N. benthamiana exprimant plaste GFP (figure 3A), ou après avoir utilisé CFDA pour colorer les chloroplastes isolés de N. benthamiana (figure 3B) ou Spinacia oleracea (figure 3C).
Figure 1. Quantification fréquence stromule en N. benthfeuilles de amiana. (A) A z -stack d'un champ de vue partiel de l'épiderme de N. benthamiana stroma exprimant la GFP a été fusionné pour afficher toutes les chloroplastes épidermiques et stromules en une seule image. (B) Cette image a été convertie en noir et blanc et inversée à des fins visuelles. Chloroplastes avec stromules sont indiqués par un astérisque magenta; chloroplastes sans stromules sont indiqués par un astérisque vert. Les barres d'échelle représentent 10 um. Modifié à partir de Brunkard et al. 9 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Comparaison des fréquences stromule dans des conditions. Ce protocole a été utilisé pour déterminer la strfréquence Omule dans 22 usines dans la journée et 24 plantes la nuit. Fréquence Stromule était significativement plus élevée pendant la journée que la nuit (t le test de Welch, n ≥ 22, p <0,0005). Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard. Modifié à partir de Brunkard et al. 9 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Visualisation stromules après l' extraction de chloroplastes intacts à partir de feuilles. (A) chloroplastes de N. transgénique benthamiana laisse GFP exprimé (vert) ciblée vers le chloroplaste ont été isolés en utilisant les protocoles décrits ici. (B) Les chloroplastes ont été isolés de type sauvage N. benthamiana feuilles et colorées avec CFDA, qui fluoresces seulement à l'intérieur, les chloroplastes viables intactes (en jaune). (C) Les chloroplastes peuvent également être isolés à partir d' autres espèces végétales, comme les épinards (S. oleracea), puis colorées avec CFDA (jaune). Chlorophylle autofluorescence est affiché en rouge. Modifié à partir de Brunkard et al. 9
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Discussion
Lors de l'instruction stromules, trois facteurs importants doivent être pris en considération tout au long de: (i) la manipulation du tissu végétal doit être maintenu à un minimum absolu, (ii) le système expérimental doit être maintenue constante, et (iii) les stratégies d'échantillonnage doit être soigneusement planifiée pour assurer robuste, des données reproductibles sont analysées.
Stromules sont remarquablement dynamiques: ils peuvent prolonger et se rétracter rapidement devant les yeux d'un observateur sous le microscope. En outre, la fréquence stromule varie considérablement en réponse à un large éventail de traitements, y compris des stimuli qui ne peuvent pas être évités afin de visualiser stromules (comme la feuille blessure). La principale solution à ce problème, qui est adressé aux protocoles décrits ici, est de mener des expériences bien contrôlées, en gardant toutes les variables cohérentes. Cela inclut, par exemple, la préparation de chaque échantillon pour visualiser immédiatement avant de l'amener au microscope; les plantes ne doivent pas être endommagésqu'immédiatement avant la visualisation. La deuxième solution à ce problème est de minimiser la complexité des protocoles: idéalement, les traitements doivent être appliqués directement à la plante sans enlever la feuille ou de causer des dommages.
Stromules ont été étudiés dans un éventail étourdissant des espèces et des types de cellules, y compris les poils de blé de racines, les fruits de tomate, et des plants de tabac étiolées 8,19. Ces études pionnières avancées de la compréhension de la dynamique des stromule au cours du développement des plantes et exploré l'éventail des activités stromule. Faire des comparaisons à partir de ces différents systèmes expérimentaux, cependant, peut conduire à des interprétations erronées, puisque les différents types de plastes sont impliqués dans considérablement différents processus biologiques.
Par exemple, les chloroplastes font stromules en réponse au stress oxydatif provoqué par la chaîne photosynthétique d'électrons, mais étant donné le manque leucoplastes appareil photosynthétique, ils ne sont pas sensibles à lamêmes stimuli 9. Tout système expérimental peut être utilisé pour étudier stromules, mais le système expérimental doit être maintenue cohérente tout au long de l'étude, si les comparaisons sont à tirer. Les facteurs à considérer comprennent les espèces, le type de cellules, le stade de développement ou l'âge de la plante, et la méthode de stromules de coloration (que ce soit par une expression stable du transgène, l'expression du transgène transitoire, ou un fluorophore externe); même de légères variations de ces facteurs peuvent fausser l'interprétation ultérieure des résultats.
Enfin, toute étude de la biologie stromule doit utiliser une stratégie d'échantillonnage robuste, fiable pour garantir que les résultats sont reproductibles et biologiquement pertinents. Échantillonnage à plusieurs reprises à partir d' une seule plante, par exemple, prendre des images à partir de plusieurs régions d'une feuille, sera apparemment améliorer la puissance statistique, mais peut être trompeuse. Comme on le voit dans les données représentatives ci-dessus, la fréquence de stromule d'une seule feuille peut varier considérablement de la fréquence moyenne stromuledans de nombreuses feuilles: en ce que la feuille, qui a été visualisée au cours de la journée, 37,9% des chloroplastes fait stromules, bien que la fréquence stromule moyen pour feuilles au cours de la journée était presque la moitié, seulement 20,8%.
En outre, compte tenu de la façon dont on sait peu sur la dynamique stromule à cette époque, toute expérience doit être entièrement reproduit au moins trois fois, et plus si possible, afin d'assurer que les variables imprévues ne sont pas responsables des éventuelles modifications de l'activité stromule qui sont observées. Avant toute chose, puisque le champ stromule de biologie commence à peine à décoller, les chercheurs devraient soigneusement documenter et signaler tous les aspects de la conception expérimentale, y compris les écarts de création du protocole simple décrit ici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss Inc | Model: LSM710 | |
| Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Waring blender | Waring | Model: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Open-source software for analyzing biological images |
References
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