We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Reporter mus er ofte blevet brugt til at observere lokalisering af ekspression af målrettede gener. Denne protokol fokuserer på en strategi for at etablere en ny transgen reporter musemodel. Vi valgte at visualisere interleukin (IL) 22-genekspression, fordi dette cytokin har betydelige aktiviteter i tarmen, hvor det bidrager til at reparere væv er beskadiget af inflammation. Reportersystemer giver betydelige fordele frem for andre metoder til at identificere produkter in vivo. I tilfældet med IL-22, havde andre undersøgelser først isoleret celler fra væv og derefter re-stimulerede celler in vitro. IL-22, der normalt secerneres, blev fanget inde celler under anvendelse af et lægemiddel, og intracellulær farvning blev anvendt til at visualisere den. Denne metode identificerer celler i stand til at producere IL-22, men det afgør ikke, om de gjorde det in vivo. Reporter design omfatter indsættelse af et gen for et fluorescerende protein (tdTomato) i IL-22-genet på en sådan way at det fluorescerende protein ikke kan secerneres og derfor forbliver fanget inde i producerende celler in vivo. Fluorescerende producenter kan derefter visualiseres i vævssnit eller ved ex vivo-analyse gennem flowcytometri. Selve byggeprocessen for reporteren inkluderet recombineering en bakteriel kunstigt kromosom, som indeholdt IL-22-genet. Denne manipuleret kromosom blev derefter indført i musegenomet. Homøostatiske IL-22 reporter ekspression blev observeret i forskellige musevæv, herunder milt, thymus, lymfeknuder, Peyerske plak, og tarm, ved hjælp af flowcytometri-analyse. Colitis blev induceret af T-celle (CD4 + CD45RBhigh) overførsel, og reporter udtryk blev visualiseret. Positive T-celler blev første stede i de mesenteriske lymfeknuder og derefter de ophobes inden i lamina propria af de distale tyndtarm og tyktarm væv. Strategien hjælp AKB gav gode-fidelity reporter udtryk i forhold til IL-22 expresnen, og det er enklere end knock-in procedurer.
Celletype-specifik ekspression af reportergener er nyttigt at identificere celler aktivt udtrykker målet i væv under homeostatiske og perturberede stater. Det giver også mulighed for oprensning af disse celler, som forbliver levedygtige, at studere deres andre egenskaber. Reporter mus er blevet anvendt til at belyse virkningsmekanismen for specifikke cytokiner, transkriptionsfaktorer og regulatoriske elementer. Tidligere strategier 1, 2, har tre stort set påberåbt sig banke reporter ind i målet locus i musen kromosomet, en tidskrævende og bekostelig procedure. Således er en enklere metode til generering af reporter mus er ønskelig.
Cytokiner er en bred klasse af små, secernerede proteiner / peptider, der regulerer immunresponser gennem intercellulære signalering. Interleukin 22 (IL-22) er et cytokin med mange rapporterede aktiviteter, herunder barriere function, væv reparation, og inflammation 4. Skønt IL-22 blev oprindeligt opdaget som en T-celle produkt 5, efterfølgende rapporter vist sin ekspression i naturlige dræberceller (NK) celler hos mennesker 6 og mus 7 og i andre klasser af medfødte lymfocytter 8. Trods omfattende observation af IL-22-celler, visualisering af IL-22 tidligere krævede ex vivo-stimulering og permeabilisering for pletter med antistoffer. Derfor ville hidtil ukendte IL-22 reporter mus være et meget nyttigt værktøj til at undersøge funktionen af IL-22 i homeostatiske og patogene processer.
Her har vi udviklet et forenklet transgen reporter musemodel at observere IL-22-producerende celler in vivo og in vitro. Ved hjælp af en BAC recombineering metode 9, vi indsat tdTomato cDNA sekvensen med Poly et signal fragmenter i IL-22 locos og erstattet exon 1. De andre utranslaterede regioner, exoner og regulerende elementer blev ikke forstyrres, da vi gerne vil efterligne den naturlige regulering af IL-22 så meget som muligt. Stedet for reporter insertion forstyrrer signalsekvensen, hvilket resulterer i akkumulering af reporteren inde i producerende celler, i modsætning til IL-22 selv, som hurtigt udskilles. Denne nye metode kan også anvendes til generering af reporter-mus for andre secernerede proteiner.
IL-22 spiller en vigtig rolle i medfødte værtsforsvar og vævsremodellering. IL-22-celler er blevet identificeret ex vivo ved intracellulær farvning. Dog stadig vanskeligt at spore IL-22-ekspression in situ, i normal tilstand eller i inflammatoriske tilstande. Denne protokol beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde til at udvikle en IL-22 reporter musemodel, hvilket gør det muligt at lokalisere reporter-udtrykkende celler in vivo. Reporter gen, der koder TdTomato blev indsat i IL-22 locus…
The authors have nothing to disclose.
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
Dnase I | Roche | 10104159001 | |
ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |