Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
ratinhos repórter têm sido amplamente utilizados para se observar a localização da expressão de genes alvo. Este protocolo centra-se em uma estratégia para estabelecer um novo modelo de rato transgénico repórter. Escolhemos para visualizar a expressão do gene interleucina (IL) 22 porque esta citoquina tem actividades importantes no intestino, onde contribui para a reparação de tecidos danificados por inflamação. Sistemas repórter oferecem vantagens consideráveis sobre outros métodos de identificação de produtos in vivo. No caso de IL-22, outros estudos havia células a partir de tecidos isolado pela primeira vez e, em seguida, re-estimularam as células in vitro. IL-22, que é normalmente secretada, foi aprisionado no interior das células utilizando um medicamento, e coloração intracelular foi usada para visualizar. Este método identifica células capazes de produzir IL-22, mas não determinar se eles estavam fazendo isso in vivo. O design repórter inclui a inserção de um gene para uma proteína fluorescente (tdTomato) para o gene de IL-22 de tal waY que a proteína fluorescente não pode ser segregada e, portanto, permanece preso no interior das células que produzem in vivo. Produtores fluorescentes podem então ser visualizado em secções de tecidos ou por meio de análise ex vivo através de citometria de fluxo. O processo de construção efectiva para o repórter incluídos recombineering um cromossoma artificial bacteriano que continha o gene de IL-22. Este cromossoma manipulado foi então introduzido no genoma do rato. Homeostático de IL-22 de expressão de repórter foi observada em diferentes tecidos de rato, incluindo o baço, timo, nódulos linfáticos, placas de Peyer, e no intestino, por análise de citometria de fluxo. A colite foi induzida por células T (CD4 + CD45RBhigh) de transferência, e expressão repórter foi visualizado. As células T positivas foram pela primeira vez presente nos linfonodos mesentéricos, e então eles acumulada no interior da lâmina própria das distais pequenos tecidos do intestino e cólon. A estratégia utilizando BACs deu expressão repórter boa fidelidade em relação a IL-22 expression, e é mais simples do que os procedimentos knock-in.
Introduction
expressão específica do tipo celular de genes repórter é útil para identificar as células que expressam activamente o alvo em tecidos sob estados homeostáticos e perturbados. Também permite a purificação destas células, que permanecem viáveis, para estudar as suas outras propriedades. Reporter ratinhos foram utilizados para elucidar o mecanismo de acção de citoquinas factores de transcrição específicos, e elementos reguladores. Estratégias anteriores 1, 2, 3, em grande medida invocado batendo o repórter para o locus alvo no cromossoma do rato, um procedimento demorado e dispendioso. Assim, um método mais simples para a geração de ratinhos repórter é desejável.
Citocinas são uma classe ampla de pequenas proteínas excretadas / péptidos que regulam as respostas imunitárias através da sinalização intercelular. A interleucina 22 (IL-22) é uma citoquina com muitos relataram actividades, incluindo fu barreiranction, reparação de tecidos, e inflamação 4. Embora a IL-22 foi inicialmente descoberto como um produto de células T 5, relatórios subsequentes demonstraram a sua expressão em células assassinas naturais (NK) em seres humanos e ratinhos 6 7 e em outras classes de linfócitos inatas 8. Apesar de extensa observação da IL-produzindo-22 células, visualização de IL-22 estimulação exigido anteriormente ex vivo e permeabilização a manchas com anticorpos. Portanto, o romance IL-22 ratos repórter seria uma ferramenta muito útil para investigar a função da IL-22 nos processos homeostáticos e patogênicos.
Aqui, nós desenvolvemos um modelo de ratinho transgénico repórter simplificado para observar as células IL-22 produtoras in vivo e in vitro. Usando um método TAS recombineering 9, que inserida a sequência de ADNc com poli A tdTomato fragmentos do sinal para a IL-22 locnós e substituído exão 1. As outras regiões, exons, e elementos reguladores não traduzidas não foram perturbado, uma vez que gostaria de imitar a regulação natural da IL-22, tanto quanto possível. O local de inserção repórter interrompe a sequência de sinal, resultando na acumulação do repórter no interior das células que produzem, ao contrário de IL-22 em si, que é rapidamente segregada. Este novo método também pode ser aplicado para a geração de ratinhos repórter de outras proteínas secretadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 desempenha um papel essencial na inata defesa e tecido hospedeiro remodelação. IL-22 produtoras de células foram identificados ex vivo por coloração intracelular. No entanto, continua a ser difícil de controlar a expressão de IL-22 in situ, quer no seu estado normal ou em condições inflamatórias. Este protocolo descreve um novo método para desenvolver um modelo de ratinho repórter de IL-22, o que nos permite localizar as células que expressam o repórter in vivo. A codifica?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
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