Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
Reporter-Mäuse wurden weithin verwendet, um die Lokalisierung der Expression von Genen gezielt zu beobachten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf eine Strategie einen neuen transgenen Reporter Mausmodell zu etablieren. Wir entschieden uns für Interleukin (IL) 22 Genexpression zu visualisieren, da dieses Zytokin wichtige Aktivitäten im Darm hat, wo sie einen Beitrag durch eine Entzündung beschädigte Gewebe zu reparieren. Reporter – Systeme bieten erhebliche Vorteile gegenüber anderen Methoden der Produkte in vivo zu identifizieren. Im Falle von IL-22, hatte andere Studien ersten Zellen aus Geweben isoliert und dann die Zellen in vitro erneut stimuliert. IL-22, das normalerweise ausgeschieden wird, wurde in den Zellen unter Verwendung eines Arzneimittels gefangen, und die intrazelluläre Färbung wurde verwendet, um es zu visualisieren. Dieses Verfahren identifiziert Zellen, die Herstellung von IL-22, aber nicht bestimmen , ob sie in vivo Dabei wurden. Der Reporter Design enthält ein Gen für ein fluoreszierendes Protein (tdTomato) in den IL-22-Gen in einer solchen wa Einfügeny , die das fluoreszierende Protein nicht sezerniert werden und bleibt daher in den produzierenden Zellen in vivo gefangen. Fluoreszierende Produzenten können dann in Gewebeschnitten oder durch ex vivo Analyse durch Durchflusszytometrie visualisiert werden. Die eigentlichen Bauprozess für die Reporter enthalten ein bakterielles künstliches Chromosom Recombineering, die die IL-22-Gen enthielt. Dieses erzeugte Chromosom wurde dann in das Mausgenom eingeführt. Homöostatischen IL-22-Reporter-Expression in verschiedenen Mausgeweben, einschließlich der Milz, Thymus, Lymphknoten, Peyerschen Plaques und Darm, durch Durchflusszytometrie-Analyse beobachtet. Kolitis wurde von T-Zellen (CD4 + CD45RBhigh) Transfer induziert und Reporterexpression sichtbar gemacht wurde. Positive T-Zellen wurden zunächst die in den mesenterischen Lymphknoten und dann akkumuliert sie in der Lamina propria des distalen Dünndarm und Dickdarm Gewebe. Die Strategie BACs gab gute Treue Reporterexpression im Vergleich zu IL-22 Expres mitsion, und es ist einfacher als Knock-in-Verfahren.
Introduction
Zelltyp-spezifische Expression von Reportergenen ist nützlich exprimierenden Zellen in das Zielgewebe unter homöostatischen und gestörter Zustände aktiv zu identifizieren. Es ermöglicht auch die Reinigung dieser Zellen, die lebensfähig bleiben, ihre anderen Eigenschaften zu untersuchen. Reporter-Mäuse wurden bei der Aufklärung der Wirkmechanismus für bestimmte Zytokine, Transkriptionsfaktoren und regulatorische Elemente verwendet. Bisherigen Strategien 1, 2, 3 haben sich auf Klopfen der Reporter in den Ziel – Locus in der Maus – Chromosom, ein zeitraubende und kostspieliges Verfahren weitgehend verlassen. Somit ist eine einfachere Methode zur Erzeugung von Reportermäusen wünschenswert.
Cytokine sind eine breite Klasse von kleinen, sekretierte Proteine / Peptide, die Immunreaktionen durch interzelluläre Signalübertragung regulieren. Interleukin 22 (IL-22) ist ein Zytokin mit vielen Aktivitäten berichtet, einschließlich Barriere function, die Reparatur von Gewebe und Entzündungen 4. Obwohl IL-22 anfangs als T-Zellprodukt 5 demonstrierte nachfolgende entdeckt wurde berichtet seine Expression in natürlichen Killer (NK) -Zellen in Menschen und Mäusen 6 7 und in anderen Klassen von angeborenen Lymphozyten 8. Trotz intensiver Beobachtung von IL-22-produzierenden Zellen, die Visualisierung von IL-22 bisher erforderlichen ex vivo Stimulation und Permeabilisierung zu Flecken mit Antikörpern. Daher wäre Roman IL-22-Reporter-Mäuse ein sehr nützliches Werkzeug, um die Funktion von IL-22 in Homöostase und pathogenen Prozessen zu untersuchen.
Hier entwickelten wir ein vereinfachtes transgenes Mausmodell reporter die IL-22-produzierenden Zellen in vivo und in vitro zu beobachten. Mit Hilfe eines BAC Recombineering Methode 9, legten wir die tdTomato cDNA – Sequenz mit Poly – A – Signal – Fragmente in die IL-22 locuns und ersetzt Exon 1. Die anderen untranslatierten Regionen, Exons und regulatorische Elemente nicht gestört wurden, da wir die natürliche Regulation von IL-22, so viel wie möglich zu imitieren möchten. Der Ort der Reporter Insertion unterbricht die Signalsequenz, was zu der Ansammlung des Reporter innerhalb der produzierenden Zellen, im Gegensatz zu IL-22 selbst, die schnell ausgeschieden wird. Dieses neue Verfahren kann auch zur Erzeugung von Reportermäusen für andere sekretierte Proteine angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 spielt eine wesentliche Rolle bei der angeborenen Immunabwehr und Gewebeumbau. IL-22-produzierenden Zellen wurden ex vivo durch intrazelluläre Anfärbung identifiziert. Allerdings bleibt es immer noch schwierig , IL-22 – Expression in situ zu verfolgen, entweder im normalen Zustand oder in entzündlichen Erkrankungen. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren ein IL-22 – Reporter Mausmodell, das uns die Reporter-exprimierenden Zellen in vivo zu lokalisieren ermöglicht zu entwicke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
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