Visualisering av IL-22-uttryckande lymfocyter med hjälp av Reporter Möss
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
Reporter möss har ofta använts för att observera lokaliseringen av expressionen av målinriktade gener. Detta protokoll är inriktat på en strategi för att etablera en ny transgen reporter musmodellen. Vi valde att visualisera interleukin (IL) 22 genuttryck, eftersom detta cytokin har viktiga verksamheter i tarmen, där det bidrar till att reparera vävnad som skadats av inflammation. Reporter system erbjuder betydande fördelar jämfört med andra metoder för att identifiera produkter in vivo. I fallet med IL-22, hade andra studier isolerades först celler från vävnader och sedan återstimulerade cellerna in vitro. IL-22, som normalt utsöndras, var instängd i celler med användning av ett läkemedel, och intracellulär färgning användes för att visualisera den. Denna metod identifierar celler med förmåga att producera IL-22, men det bestämmer inte om de gjorde så in vivo. Reportern designen inkluderar insättning av en gen för ett fluorescerande protein (tdTomato) in i den IL-22-genen i en sådan way att det fluorescerande proteinet inte kan utsöndras och därför förblir instängd i de producerande celler in vivo. Fluorescerande producenter kan sedan visualiseras i vävnadssnitt eller genom ex vivo analys genom flödescytometri. Själva byggprocessen för reportern ingår recombineering en bakteriell artificiell kromosom som innehöll IL-22-genen. Denna engineered kromosom infördes sedan i musgenomet. Homeostatiska IL-22 reporterexpression observerades i olika musvävnader, inklusive mjälte, tymus, lymfkörtlar, Peyers plaque, och tarmarna, genom flödescytometrianalys. Kolit inducerades genom T-cell (CD4 + CD45RBhigh) överföring, och reporterexpression visualiserades. Positiva T-celler var först närvarande i de mesenteriska lymfkörtlarna, och sedan de ackumuleras inuti lamina propria av de distala tunntarmen och kolon vävnader. Strategin använder BAC gav god trohet reporter uttryck jämfört med IL-22 expressionen, och det är enklare än knock-i försök.
Introduction
Celltyp-specifik expression av reportergener är användbara för att identifiera celler som aktivt uttrycker målet i vävnader under homeostatiska och störda tillstånd. Det möjliggör också för rening av dessa celler, som fortfarande är livskraftiga, för att studera deras andra egenskaper. Reporter möss har använts för att belysa verkningsmekanismen för specifika cytokiner, transkriptionsfaktorer, och regulatoriska element. Tidigare strategier 1, 2, har tre i stort sett förlitat sig på att knacka reportern in i mållokuset i mus kromosom, en tidsödande och kostsam procedur. Sålunda är det önskvärt med en enklare metod för generering av reporter möss.
Cytokiner är en bred klass av små, utsöndrade proteiner / peptider som reglerar immunsvar genom intercellulär signalering. Interleukin 22 (IL-22) är en cytokin med många rapporterade aktiviteter, inklusive spärr funktion, vävnadsreparation, och inflammation 4. Även IL-22 var ursprungligen upptäcktes som en T-cellprodukt 5, efterföljande rapporter visade sitt uttryck i naturliga mördarceller (NK) i människa 6 och möss 7 och i andra typer av medfödda lymfocyter 8. Trots omfattande observation av IL-22-producerande celler, visualisering av IL-22 tidigare krävdes ex vivo stimulering och permeabilisering till fläckar med antikroppar. Därför skulle nya IL-22 reporter möss vara ett mycket användbart verktyg för att undersöka funktionen av IL-22 i homeostatiska och patogena processer.
Här har vi tagit fram en förenklad transgen reporter musmodell att observera IL-22-producerande celler in vivo och in vitro. Med hjälp av en BAC recombineering metod 9, införas vi tdTomato cDNA-sekvensen med Poly en signal fragment i IL-22 locoss och ersatte exon 1. De andra oöversatta regioner, exoner och regulatoriska element inte störd, eftersom vi vill efterlikna den naturliga regleringen av IL-22 så mycket som möjligt. Platsen av reporter införing stör signalsekvensen, vilket resulterar i ansamling av reportern inuti de producerande cellerna, till skillnad från IL-22 i sig, som snabbt utsöndras. Denna nya metod kan också appliceras på genereringen av reporter möss för andra utsöndrade proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 spelar en viktig roll i medfödda värdförsvar och vävnadsombildning. IL-22-producerande celler har identifierats ex vivo genom intracellulär färgning. Men fortfarande det svårt att spåra IL-22 expression in situ, antingen i det normala tillståndet eller inflammatoriska tillstånd. Detta protokoll beskriver en ny metod för att utveckla en IL-22 reporter musmodell som gör det möjligt för oss att lokalisera reporter-uttryckande celler in vivo. Reportergenen kodar för tdTomato s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, d. e., R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
