Automatiseret Kvantificering og analyse af celletælling Procedurer Brug ImageJ Plugins
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
Statens Institut for Sundhedsstyrelsens ImageJ er en kraftfuld, frit tilgængelig billedbehandling software suite. ImageJ har omfattende partikel algoritmer, som kan anvendes effektivt til at tælle forskellige biologiske partikler. Når tælle stort antal celleprøver, hæmocytometeret præsenterer en flaskehals med hensyn til tid. Ligeledes tælle membraner fra migration / invasion analyser med ImageJ plugin Cell Counter, selvom præcis, er usædvanligt arbejdskrævende, subjektive, og berygtet for at forårsage håndled smerter. For at imødekomme dette behov, har vi udviklet to plugins inden ImageJ for den eneste opgave automatiseret hæmocytometer (eller kendt volumen) og migration / invasion celletælling. Begge plugins stole på evnen til at tilegne høj kvalitet mikrografier med minimal baggrund. De er nemme at bruge og optimeret til hurtig optælling og analyse af store stikprøvestørrelser med indbyggede analyseværktøjer til at hjælpe kalibrering af tæller. Ved at kombinere det centrale princips of Cell Counter med en automatiseret optælling algoritme og post-optælling analyse, hvilket forøger den lethed, hvormed migration assays kan behandles uden tab af nøjagtighed.
Introduction
In vitro celletælling er en vigtig grundlæggende teknik i en lang række vævskultur eksperimenter. Nøjagtig bestemmelse af antallet af celler i en kultur er afgørende for eksperimentel reproducerbarhed og standardisering 1,2. Celletælling kan udføres manuelt under anvendelse af et hæmocytometer samt anvendelse af en række automatiserede metoder, hver med deres egne fordele og ulemper 3,4,5. De fleste af de automatiserede metoder til celletælling tilhører en af to klasser, dem, der bruger Coulter-princippet eller flowcytometri. Coulter tællere drage fordel af celler elektrisk modstand for at bestemme celle antal og størrelse. De er hurtige, præcise og billigere end flowcytometre. Men de er sjældent til kun celletælling på grund af deres betydelige omkostninger sammenlignet med manuel tælling 3. Flowcytometre, på den anden side, er dyre, men de har mange applikationer såsom celletælling, analyse af celler form, structure og måling indre cellemarkører 4,5. Maskiner, der bruger en af disse to principper er tilgængelige fra mange producenter. Manuel optælling er overkommelige, men tidskrævende og underlagt fordomme, mens de automatiserede metoder kommer med en brøkdel af den tid, der kræves for den manuelle optælling, men ved hjælp af dyre maskiner 6.
Andre almindelige cellekultur procedurer er in vitro celle motilitet assays, nemlig celle migration og invasion 7. Migration og invasion-assays er almindeligt anvendt til at undersøge cellemotilitet og invasivitet som svar på en kemotaktisk respons. Desuden er de i vid udstrækning anvendes til at studere fosterudvikling, differentiering, inflammatorisk respons, og metastase af flere celletyper 7-11. Celler, der er migreret eller invaderet gennem den porøse membran af en migration assay kan kvantificeres på to forskellige måder. For det første, ved farvning af cellerne med et fluorescerende farvestof, dissociation from membranen, og kvantificering ved anvendelse af et fluorescerende læser 12. En begrænsning ved denne metode til kvantificering er, at ingen post kan bevares af membranerne, og der er ingen mulighed for yderligere analyse 13. Den anden kvantificering metode er for migreret / invaderet celler, der skal faste og farvet med fluorescerende farvestof eller mere almindeligt, med cytologiske farvestoffer såsom krystalviolet, toluidinblåt farvestof eller hæmatoxylin; så cellerne kvantificeres manuelt med inverterede mikroskopiske billeder af disse membraner, som er en meget tidskrævende opgave 12,13.
At overvinde ulemperne af manualen celletælling blev to pålidelige og præcise automatiserede celle tællere for cellekoncentration og for migration assay udviklet. Disse automatiserede celletæller algoritmer udviklet til ImageJ som et plugin bruger Oracles Java edb-sprog. ImageJ er en offentlig og udbredt billedbehandling værktøj udviklet af National Institute of HeaLTH (NIH) 14,15; derfor, skriver disse plugins til ImageJ letter nem integration i det biologiske samfund.
Automatisering af celletælling sikrer høj produktivitet og reproducerbarhed sammenlignet med manuel tælling. Selvom andre tilgængelige software og plugins kan bruges til at beregne celle koncentration gennem billedanalyse 5,16,17, Cell Koncentration Lommeregner plugin er hurtig og kan også håndtere fortyndinger af celler og behandlinger. Desuden kan alle resultater og beregninger fra disse to tællere gemmes og eksporteres. De to plugins, der er beskrevet i dette dokument er optimeret til brug for en fasekontrastmikroskop for levende celler og stort synsfelt (hele membran capture) billeddannelse til migration assay membraner gennem brug af en dissekere omfang. De plugins er frit tilgængelige for download med monteringsvejledning fra: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske Steps, fejlfinding og begrænsninger
Selve karakteren af automatiserede beregningsmetoder, navnlig vedrørende partikel analyse, nødvendiggør den matematiske evne til at definere disse partikler. Derfor nøjagtigheden af både Cell Koncentration Lommeregner og migration assay tælleren er majorly afhængig af billedet troskab, det vil sige, hvor tæt det optagne billede ligner celleprøven eller migration assay membran. Det er derfor af den største betydning at følge mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016)
- Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
- Ormerod, M. G., Imrie, P. R., Walker, J. M., Pollard, J. W. Flow cytometry. Animal Cell Culture. , 543-558 (1990).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C., Stoddart, J. M. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , 7-12 (2011).
- Scott, W. N., Langdon, S. P. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , 225-229 (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
- Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
- Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
- Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
- Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
- Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
- Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
- . Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
- . Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , (2016).
