Geautomatiseerde kwantificering en analyse van Cell Counting Procedures Met behulp van ImageJ Plugins
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
Het National Institute of Health ImageJ is een krachtige, vrij beschikbare software voor beeldverwerking suite. ImageJ heeft uitgebreide deeltjes algoritmes die effectief kan worden gebruikt om verschillende biologische deeltjes tellen. Bij het tellen van een groot aantal van de cel monsters, de hemocytometer presenteert een knelpunt met betrekking tot de tijd. Ook het tellen van membranen van migratie / invasie assays met de ImageJ plugin Cell Counter, hoewel nauwkeurige, is bijzonder arbeidsintensief, subjectief en berucht voor het veroorzaken van pols pijn. Om aan deze behoefte te pakken, ontwikkelden we twee plugins in ImageJ voor de enige taak van geautomatiseerde hemocytometer (of bekende volume) en migratie / invasie cel tellen. Beide plugins berusten op het vermogen om hoge kwaliteit microfoto verkrijgen met minimale achtergrond. Ze zijn gemakkelijk te gebruiken en geoptimaliseerd voor snelle telling en analyse van grote aantallen individuen met ingebouwde analyse-instrumenten kalibratie tellingen helpen. Door de kernbeginsels Cell Counter met een geautomatiseerde telling algoritme en na telling analyse Dit verhoogt het gemak waarmee migratie assays zonder verlies aan nauwkeurigheid kan worden verwerkt.
Introduction
In vitro celtelling is een belangrijke basistechniek in uiteenlopende weefselkweek experimenten. Het nauwkeurig bepalen van het aantal cellen in een cultuur essentieel voor experimentele reproduceerbaarheid en standaardisatie 1,2. Celtelling kan handmatig worden uitgevoerd met behulp van een hemocytometer en met behulp van verschillende geautomatiseerde methoden, elk met hun eigen voordelen en nadelen 3,4,5. De meeste geautomatiseerde werkwijzen voor celtelling behoren tot een van twee klassen, die de Coulter-principe gebruikt of flowcytometrie. Coulter tellers profiteer van cellen elektrische weerstand naar cel aantal en de grootte te bepalen. Ze zijn snel, nauwkeurig en goedkoper dan flowcytometers. Ze worden echter zelden gebruikt alleen celtelling vanwege de aanzienlijke kosten dan bij handmatige telling 3. Stromingscytometers, daarentegen, zijn duur, maar ze hebben vele toepassingen zoals celtelling analyse van de vorm cellen, structure en het meten van de interne cel markers 4,5. Machines die een van deze twee principes gebruiken zijn verkrijgbaar bij vele fabrikanten. Handmatige telling is betaalbaar maar tijdrovend en onder voorspanning terwijl de geautomatiseerde methoden hebben een fractie van de tijd die de handmatige telling maar het gebruik van dure machines 6.
Andere veel voorkomende celcultuur procedures zijn in vitro cel beweeglijkheid assays, namelijk cel migratie en invasie 7. Migratie en invasie assays worden vaak gebruikt om celmotiliteit en invasiviteit onderzoeken reactie op een chemotactische respons. Bovendien worden ze veel gebruikt embryonale ontwikkeling, differentiatie, ontstekingsreactie, en metastase van verschillende celtypen 7-11 bestuderen. Cellen die gemigreerd of binnengedrongen door het poreuze membraan van een migratie assay kan worden gekwantificeerd op twee verschillende manieren. Ten eerste door het kleuren van de cellen met een fluorescerende kleurstof, dissociatie from het membraan en kwantificering met een fluorescerende reader 12. Een beperking van deze methode is dat kwantificering geen record kan worden behouden de membranen en er geen mogelijkheid voor verdere analyse 13. De tweede methode is kwantificering gemigreerde / binnengedrongen cellen worden gefixeerd en gekleurd met fluorescente kleurstof of vaker met cytologische kleurstoffen zoals kristalviolet, toluidine blauwe kleurstof of hematoxyline; dan cellen worden gekwantificeerd handmatig met behulp van omgekeerde microscopische beelden van deze membranen dat is een zeer tijdrovende taak 12,13.
Om de nadelen van handmatige celtelling overwinnen, werden twee betrouwbare en nauwkeurige geautomatiseerde celtellers voor celconcentratie en de migratie assay ontwikkeld. Deze geautomatiseerde celgetalmeter algoritmes werden ontwikkeld voor ImageJ als een plugin met behulp van Oracle's Java programmeertaal. ImageJ is een publiek en veel gebruikte beeldverwerking tool ontwikkeld door het Nationaal Instituut voor HeaLTH (NIH) 14,15; dus, het schrijven van deze plugins voor ImageJ vergemakkelijkt de integratie in de biologische gemeenschap.
Automatisering van de cel tellen zorgt voor een hoge doorvoersnelheid en reproduceerbaarheid in vergelijking met handmatige telling. Hoewel andere beschikbare software en plugins kunnen worden gebruikt om celconcentratie berekenen met beeldanalyse 5,16,17, celconcentraties Calculator plug is snel en kan ook overweg verdunningen van cellen en behandelingen. Bovendien kunnen alle resultaten en berekeningen van deze twee tellers worden opgeslagen en uitgevoerd. De twee plugins in dit document beschreven zijn geoptimaliseerd voor het gebruik van een fasecontrastmicroscoop voor live cell imaging en groot gezichtsveld (gehele membraan capture) beeldvorming voor migratieanalyse membranen met behulp van een dissectie scope. De plugins zijn vrij beschikbaar voor download met installatie-instructies uit: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Stappen, problemen oplossen, en beperkingen
De aard van geautomatiseerde rekenmethoden, bijzonder diegenen van deeltjesanalyse, vereist de wiskundige mogelijkheid om deze deeltjes te bepalen. Bijgevolg is de nauwkeurigheid van beide Cell Concentratie Calculator en migratie test teller is majorly afhankelijk van het trouw, dat wil zeggen, hoe nauw het opgenomen beeld lijkt op de cel monster of migratie assay membraan. Het is daarom van het grootste belang om microscoop en de bijbehoren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016)
- Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
- Ormerod, M. G., Imrie, P. R., Walker, J. M., Pollard, J. W. Flow cytometry. Animal Cell Culture. , 543-558 (1990).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C., Stoddart, J. M. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , 7-12 (2011).
- Scott, W. N., Langdon, S. P. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , 225-229 (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
- Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
- Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
- Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
- Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
- Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
- Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
- . Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
- . Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , (2016).
