ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
Sağlık ImageJ National Institute güçlü, serbestçe kullanılabilir görüntü işleme yazılımı paketidir. ImageJ çeşitli biyolojik partiküller saymak için etkili bir şekilde kullanılabilir kapsamlı parçacık analizi algoritmaları. hücre örneklerinin çok sayıda sayım yaparken, hemositometre zaman açısından bir darboğaz sunar. Aynı şekilde, ImageJ eklentisi Cell Counter ile göç / işgali deneyleri gelen zarları sayma doğru olsa da, bilek ağrılarına sebep için son derece emek yoğun sübjektif ve rezil. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz otomatik hemasitometre (ya da bilinen hacim) ve göç / işgali hücre sayımı tek görev için ImageJ içinde iki eklentileri geliştirmiştir. Her iki eklentileri minimum arka plan ile yüksek kalitede mikrograflar elde etmek yeteneğine güveniyor. Bunlar, kullanımı kolay ve sayıları kalibrasyonunu yardımcı olmak için yerleşik analiz araçları ile geniş örneklem boyutları hızlı sayım ve analiz için optimize edilmiş. Çekirdek prensibini birleştirerekotomatik sayım algoritması ve sonrası sayma analizi ile Cell Counter s, bu büyük ölçüde göç deneyleri doğruluk kaybı olmaksızın işlenebilir kolaylığını artırır.
Introduction
In vitro hücre sayımı olarak doku kültürü deneyleri, geniş bir aralık içinde bir önemli temel bir tekniktir. Doğru bir kültürde hücre sayısının belirlenmesi deney tekrarlanabilirlik ve standardizasyon 1,2 için gereklidir. Hücre sayımı bir hemasitometre kullanarak yanı sıra otomatik çeşitli yöntemler, kendi avantajları ve dezavantajları 3,4,5 her kullanılarak elle yapılabilir. hücre sayımı için otomatik yöntemlerin çoğu iki sınıfa Coulter prensibini kullanın veya akım sitometri olanların birine ait. Coulter sayaçlar hücre sayısını ve boyutunu belirlemek için hücreler elektriksel direnç yararlanmak. Onlar akış sitometrelerinde daha hızlı, doğru ve ucuzdur. Ancak, nadiren manuel sayım 3 ile karşılaştırıldığında nedeniyle önemli ölçüde eksiksiz tek hücre sayımı için kullanılır. Öte yandan, sitometre akış pahalıdır fakat, hücre sayımı, hücreler şekil, st analizi maddesi olarakkezlerinin ve ölçüm dahili hücre 4,5 işaretleme kalemler. Bu iki ilke birini kullanın makineler birçok üretici edinilebilir. Otomatik yöntemler elle sayım için gerekli zamanın bir kısmı ile geliyor ama pahalı makineler 6 kullanırken manuel sayım uygun fiyatlı ama zaman alıcı ve önyargı tabidir.
Diğer yaygın hücre kültür işlemleri in vitro hücre motilite deneyleri, yani, hücre göçü ve yayılması 7 bulunmaktadır. Yer değiştirmesine ve istilasma deneyler genellikle bir kemotaktik yanıtı yanıt olarak, hücre motilitesinin ve invazyon araştırmak için kullanılır. Buna ek olarak, yaygın olarak birden fazla hücre tipleri 7-11 embriyonik gelişimi, farklılaşma, enflamatuvar yanıtı ve metastazı çalışma için kullanılır. Bir göç testinin gözenekli zarından göç veya işgal Hücreler iki farklı şekilde belirlenebilir. İlk olarak, bir floresan boya ile boyanması, ayrışma ile sağa solaBir floresan okuyucu 12 kullanılarak membran ve miktarının m. Miktar, bu yöntemin bir sınırlaması bir kayıt membran muhafaza edilebilir ve daha fazla analiz 13 imkanı olmasıdır. Taşınan ikinci ölçümü yöntemi / sabit ve kristal viyole, toluidin mavisi veya hematoksilen olarak sitolojik boyalar ile daha sık floresan boya veya, ile boyanmış hücrelerin işgal edildi; Daha sonra hücreler elle çok zaman alan bir görev 12,13 olan bu membranların ters mikroskopik görüntüleri kullanılarak ölçülür.
kılavuzu hücre sayımı dezavantajlarını aşmak için, hücre konsantrasyonu ve göç deneyi için iki güvenilir ve doğru otomatik hücre sayaçları geliştirilmiştir. Bunlar otomatik hücre sayıcı algoritmaları Oracle'ın Java bilgisayar dili kullanarak bir eklenti olarak ImageJ için geliştirilmiştir. ImageJ Hea Ulusal Enstitüsü tarafından geliştirilen bir kamu ve yaygın kullanılan görüntü işleme aracıdırinci (NIH) 14,15; böylece, ImageJ için bu eklentileri yazma biyolojik topluluk içine kolay entegrasyon kolaylaştırır.
hücre sayımı otomasyonu elle sayım kıyasla yüksek üretim ve tekrarlanabilirlik sağlar. Diğer uygun yazılım ve eklentiler görüntü analizi 5,16,17, hücre konsantrasyonu Hesap eklenti aracılığıyla hücre konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilir, ancak hızlı ve aynı zamanda hücre ve tedavi dilüsyonları işleyebilir. Ayrıca, bu iki sayaçları tüm sonuçlar ve hesaplamalar kaydedilir ve ihraç edilebilir. Bu yazıda anlatılan iki eklentileri diseksiyon kapsamı kullanımı yoluyla canlı hücre görüntüleme ve göç tahlil membranların için büyük görüş alanı (tüm membran yakalama) görüntüleme için bir faz kontrast mikroskop kullanımı için optimize edilmiştir. http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins: eklentileri yükleme talimatları indirmek için serbestçe kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritik Adımlar, sorun giderme ve Sınırlamalar
Otomatik hesaplama yöntemleri doğası, parçacık analizi, özellikle bu, bu parçacıkları tanımlamak için matematiksel yetenek gerektirir. Sonuç olarak, Hücre Konsantrasyon Hesaplama ve göç tahlil sayacı hem doğruluğu yakalanan görüntü hücresi örnek veya göç tahlil zarı benzer ne kadar yakından, yani resim netliği üzerinde majorly bağlıdır. Bu nedenle mümkün olduğunca en iyi olarak mikroskop ve ilgili yazılım kali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016)
- Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
- Ormerod, M. G., Imrie, P. R., Walker, J. M., Pollard, J. W. Flow cytometry. Animal Cell Culture. , 543-558 (1990).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C., Stoddart, J. M. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , 7-12 (2011).
- Scott, W. N., Langdon, S. P. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , 225-229 (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
- Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
- Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
- Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
- Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
- Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
- Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
- . Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
- . Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , (2016).
