人全血中NK细胞杀伤活性的流式细胞仪分析
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
NK细胞细胞毒性是一种广泛使用的度量，以确定外部干预的对NK细胞功能的影响。然而，该测定的准确性和重复性可以认为不稳定的，或者是因为用户的错误，或者因为NK细胞的实验操纵的敏感性。为了消除这些问题，即它们减少到最低限度的工作流正式成立，这里提出。为了说明，我们获得的血液样品中，在不同的时间点，从流道（N = 4）被提交给运动的激烈比赛的。首先，NK细胞被同时确定，并通过CD56标记和基于磁分选分离，直接从全血和从少1毫升。排序后的NK细胞被删除任何试剂或封盖抗体。他们可以以每毫升血液建立一个准确的NK细胞数量进行计数。其次，分类NK细胞（细胞效应或E）可以与3,3'- Diotade混合cyloxacarbocyanine高氯酸盐（DIO）标记的K562细胞（靶细胞或T）在一个测定最优1:5 T：E比率，并分析使用成像流式细胞仪，其允许每个事件的可视化和任何假阳性的消除或假阴性（如双峰或效应细胞）。该工作流可以在大约4小时内完成，并允许甚至与人类的样品时非常稳定的结果。空闲时，研究团队可以在人类受试者的测试几种实验的干预措施，并比较不同的几个时间点测量，而不影响数据的完整性。
Introduction
自然杀伤细胞是先天免疫系统的一个基本要素。而他们非常规，他们必须识别并通过细胞-细胞接触，而不事先活化1消除异常细胞的能力。因此，它们构成抵御感染的快速线。运动，尤其是剧烈的，已经显示出瞬时抑制免疫系统的2，3，4，5。 NK细胞是特别容易出现这种效果4，6，7，从而有效地创建增强疾病敏感性的一个窗口。因此，干预措施的研究之前，期间或剧烈运动后以减少其对NK细胞功能的影响的目的是为运动员后比赛福祉特别的兴趣。
<p class=“jove_content”>然而，这种措施的研究是由多种因素复杂：1）的NK细胞是稀疏8，在白血细胞室的约1％; 2）NK细胞对压力非常敏感，依靠不断的暴露在生理条件下保持在实验过程中可行，稳定;和3）的标准测定法来确定NK细胞细胞毒性，如聚蔗糖梯度9和释放测定法10中 ，是不可靠的和不一致的。人样品的固有变异性只会加重了这些问题。干预期间收集的新鲜人类样本是相当受管制，很难弄到，相对于动物的样品或永生细胞系的至少。这减少的机会，重复实验或增加参与者的研究队列达到显著的统计阈值。总的来说，这些问题的支持简化协议，允许FO的需要R 2均高吞吐量和人类样品中NK细胞裂解活性的高可靠性分析。我们建立了缩短所需的时间，以确定，同时尽量减少暴露于外来因素从人全血分离和测试NK细胞的工作流。该方法优化了使用两个仪器，在基于磁细胞分选和流式细胞仪的成像流，和一个特定的化验-，优化的T：E比率为允许减少或NK细胞细胞毒性的增加的检测。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这项研究中所描述的方法直接测量一个人的NK细胞响应于刺激的比活性（在此特定情况下，长时间运动）。通常情况下，NK细胞是从使用密度梯度或细胞用标记物的组合排序一个人的血液中分离。虽然这些方法被广泛使用，它们具有许多缺点：它们是耗时的，涉及多个操作，并且在很大程度上依赖于用户的。其结果是，过度的应力被放置在分离的NK细胞，这可以导致增加的可变性，从实验进行实?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
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