ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
NK細胞の細胞傷害性は、NK細胞機能の外部の介入の効果を決定するために広く使用される尺度です。しかし、このアッセイの精度および再現性があるため、ユーザのエラーのため、または実験的操作にNK細胞の感受性のいずれか、不安定と考えることができます。これらの問題を解消するために、最小限にそれらを減少させるワークフローを確立し、ここで提示されています。例示するために、我々は、運動の激しい試合に提出されたランナー（N = 4）から、様々な時点で、血液サンプルを得ました。まず、NK細胞は、同時にCD56のタグ付けと磁気ベースの選別を経て、直接全血からと1ミリリットル限り少ないから同定および分離されています。ソートされたNK細胞は、任意の試薬またはキャッピング抗体から除去されます。これらは、血液1ミリリットル当たりの正確なNK細胞数を確立するために計数することができます。第二に、ソートされたNK細胞（エフェクター細胞またはE）は、3,3'- Diotadeと混合することができます5 T：cyloxacarbocyanine過塩素酸（DIO）をアッセイ最適1でK562細胞（標的細胞またはT）をタグ付けされたE比、および各イベントの可視化および任意の偽陽性の排除を可能にするイメージングフローサイトメーターを用いて分析しましたまたは（例えばダブレットまたはエフェクター細胞など）偽陰性。このワークフローは、約4時間で完了し、さらにはヒト試料での作業は非常に安定した結果を可能にすることができます。ご利用の際は、研究チームは、ヒト対象にいくつかの実験介入をテストし、データの整合性を損なうことなく、いくつかの時点全体の測定値を比較することができます。
Introduction
ナチュラルキラー細胞は、自然免疫系の重要な構成要素です。それらは非常に規制されているが、それらは認識し、細胞間接触を介して前活性化1せずに異常な細胞を除去する能力を有します。そのようなものとして、それらは、感染に対する防御の迅速なラインを形成します。特に激しい運動は、一過性免疫系2、3、4、5を抑制することが示されています。 NK細胞は、効果的に疾患に高感度のウィンドウを作成し、この効果4、 図6、 図7を特に受けやすいです。したがって、前の介入の研究は、NK細胞機能への影響を削減するという目標との間または後の激しい運動は、運動選手のポスト競技の幸福のために特に重要です。
<p class= "jove_content">しかし、そのような介入の研究は、多くの要因によって複雑になる：1）NK細胞は、白血球区画の約1％、8まばらです。 2）NK細胞はストレスに非常に敏感であり、実験中に生存可能で安定した状態を維持するために生理学的条件に一定の暴露に依存しています。 3）標準的なアッセイは、フィコール勾配9として、NK細胞の細胞毒性を決定し、アッセイ10を解放するために、信頼できないと矛盾しています。ヒト試料の固有の変動は、これらの問題を配合します。介入の間に収集され、新鮮なヒトサンプルは、少なくとも動物サンプルまたは不死化細胞株と比較した場合、入手がかなり規制が困難です。これは、実験を繰り返したり、統計的な有意しきい値に到達するために研究コホートに参加者を追加する機会を減らすことができます。まとめると、これらの問題はfoを可能にする合理化されたプロトコルの必要性をサポートrの両方のハイスループットおよびヒト試料中のNK細胞溶解活性の高い信頼性解析。無関係な要因への曝露を最小限に抑えながら、我々は、ヒト全血から識別するために必要な時間を短縮し、ワークフロー、隔離し、テストNK細胞を確立しました。減少またはNK細胞の細胞毒性の増加の検出を可能にするE比：方法は2楽器、磁気ベースのセルソーターとイメージングフローサイトメーター、およびアッセイ特異的な、最適化されたTの使用を最適化します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究に記載された方法は、直接的（この特定の場合、長時間の運動で）刺激に応答して個々のNK細胞の特異的活性を測定します。典型的に、NK細胞は、マーカーの組み合わせを使用して選別密度勾配または細胞を使用して1つの血液から単離されます。これらの方法が広く使用されているが、それらは多くの欠点を持っている：彼らは、時間がかかり、複数の操作を伴い、かつ重くユーザー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
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