Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
NK-cellecytotoksicitet er et meget anvendt foranstaltning at bestemme virkningen af intervention udefra på NK-celle funktion. Imidlertid kan nøjagtigheden og reproducerbarheden af denne assay anses ustabil, enten på grund af brugerens fejl eller på grund af følsomheden af NK-celler til eksperimentel manipulation. For at eliminere disse problemer, blev en arbejdsgang, der reducerer dem til et minimum etableret og præsenteres her. For at illustrere, vi opnåede blodprøver, på forskellige tidspunkter, fra løbere (n = 4), som blev underkastet en intens anfald af motion. Først NK-celler samtidigt identificeres og isoleres gennem CD56 tagging og magnetisk-baseret sortering, direkte fra fuldblod og fra så lidt som en milliliter. De sorterede NK-celler fjernes eventuelle reagenser eller capping antistoffer. De kan tælles for at etablere en nøjagtig NK celletal per milliliter blod. For det andet kan de sorterede NK-celler (effektorer celler eller E) blandes med 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine Perchloratmateriale (DIO) mærkede K562-celler (målceller eller T) ved en assay-optimal 1: 5 T: E ratio, og analyseret ved hjælp af en billeddannende flow-cytometer, der giver mulighed for visualisering af hvert arrangement og afskaffelsen af enhver falsk positiv eller falsk negative (såsom dublering eller effektorceller). Denne arbejdsproces kan være afsluttet i omkring 4 timer, og giver mulighed for meget stabile resultater selv ved arbejde med humane prøver. Når tilgængelig, kan forskerhold teste flere eksperimentelle indgreb i mennesker, og sammenligne målinger på tværs af flere tidspunkter uden at kompromittere data integritet.
Introduction
Naturlige dræberceller er et væsentligt element i det medfødte immunsystem. Mens de er meget reguleret, de har evnen til at genkende og eliminere unormale celler gennem celle-til-celle-kontakt og uden forudgående aktivering 1. Som sådan udgør de en hurtig linje i forsvaret mod infektioner. Motion, især intens, har vist sig at transient nedtrykke immunsystemet 2, 3, 4, 5. NK-celler er særligt udsatte for denne effekt 4, 6, 7, i realiteten skabe et vindue af forøget følsomhed over for sygdomme. Derfor studiet af indgreb før, under eller efter intens træning med det mål at reducere dens indvirkning på NK celle funktion er af særlig interesse for trivsel atleter post-konkurrencer.
<p class= "jove_content"> Imidlertid er studiet af sådanne indgreb kompliceres af en række faktorer: 1) NK-celler er sparsomme 8, på omkring 1% af de hvide blodlegemer rum; 2) NK-celler er meget følsomme over for stress og stole på konstant udsættelse for fysiologiske betingelser at forblive levedygtig og stabil under eksperimenter; og 3) standard assays til at bestemme NK celle cytotoksicitet, såsom Ficoll gradienter 9 og frigivelse assays 10, er upålidelige og inkonsekvent. Den iboende variation af humane prøver kun forværre disse problemer. Friske humane prøver indsamlet under interventioner er temmelig reguleret og vanskelige at skaffe, i hvert fald i forhold til dyr prøver eller immortaliserede cellelinjer. Dette reducerer mulighederne for at gentage eksperimenter eller tilføje deltagere til undersøgelsen kohorte at nå betydelige statistiske tærskler. Kollektivt, disse spørgsmål støtter behovet for en strømlinet protokol, der tillader foR både high-throughput og en høj pålidelighed analyse af NK-celle lytisk aktivitet i humane prøver.Vi har etableret en arbejdsgang, der forkorter den nødvendige tid til at identificere, isolere og test NK-celler fra humant fuldblod og samtidig minimere udsættelse for udefra kommende faktorer. Metoden optimerer brugen af to instrumenter, en magnetisk-baserede celle sorteringsanlæg og en billeddannende flowcytometer, og en analyse-specifikke, optimeret T: E ratio for at tillade påvisning af fald eller stigninger på NK-celle cytotoksicitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den i dette studie metode direkte måler den specifikke aktivitet af et individs NK-celler som respons på stimuli (i dette særlige tilfælde, langvarig motion). Typisk NK-celler isoleret fra blod ved hjælp densitetsgradienter eller cellesortering ved anvendelse af en kombination af markører. Mens disse metoder i vidt omfang anvendes, de har mange ulemper: de er tidskrævende, involverer flere manipulationer, og er stærkt brugeren afhængig. Som følge heraf er unødig stress placeret på de isolerede NK celler, hvi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , (2001).
