Abstract
Растения могут производить ценные вещества, такие как вторичные метаболиты и рекомбинантных белков. Очистка последнего из растительной биомассы может быть упрощен путем термической обработки (бланширования). Побледнение устройство может быть сконструирована более точно , если тепловые свойства листьев известны в деталях, то есть, удельной теплоемкости и теплопроводности. Измерение этих свойств занимает много времени и трудоемким, и, как правило, требует инвазивных методов, которые контактируют образец непосредственно. Это может уменьшить выход продукта и могут быть несовместимы с требованиями защитной оболочки, например, в контексте надлежащей производственной практики. Для решения этих проблем, неинвазивный, бесконтактный метод был разработан, определяющий удельную теплоемкость и теплопроводность интактного листа растения в течение одной минуты. Способ включает в себя применение короткого лазерного импульса определенной длины и интенсивности на небольшой площадилист образца, в результате чего повышение температуры, которая измеряется с использованием ближнего инфракрасного датчика. Повышение температуры в сочетании с известными свойствами листа (толщины и плотности) для определения удельной теплоемкости. Теплопроводность затем вычисляется на основе профиля последующего спада температуры, принимая теплового излучения и конвективного теплопереноса в расчет. Соответствующие расчеты и критические аспекты обработки проб обсуждаются.
Introduction
Обработка крупномасштабный биологических материалов часто требует стадии термообработки, такие как пастеризация. Оборудование для таких процессов могут быть разработаны более точно , если тепловые свойства биологических материалов , хорошо охарактеризованы, в том числе удельной теплоемкости (с р, з) и теплопроводности (X). Эти параметры могут быть легко определены для жидкостей, суспензий и гомогенатах калориметрии 1. Тем не менее, измерение таких параметров , в твердых образцах может быть трудоемким и часто требует непосредственного контакта с образцом или даже его разрушения 2. Например, методы фототермические требуют непосредственного контакта между образцом и детектором 3. Такие ограничения являются приемлемыми в процессе обработки пищевых продуктов, но не совместимы с жестко регламентированных процессов , таких как производство биофармацевтических белков в растениях в контексте надлежащей производственной практики 4. яп такой контекст, повторяется (например, еженедельно) мониторинг тепловых свойств может потребоваться в течение периода роста семи недель для отдельных растений в качестве инструмента контроля качества. Если такой контроль будет требовать и потреблять лист для каждого измерения, то не было бы никакой биомассы осталось обработать во время сбора урожая.
Кроме того, использование только части листа, а не приведет к ранении на завод и увеличить риск некроза или патогена инфекции, снова снижается выход продукта. Вероятность возбудителя инфекции также может возрасти, если метод с прямым контактом с образцом будет использоваться, вызывая риск того, что вся партия растений могут быть инфицированы в результате контакта с загрязненным сенсорного устройства. Подобные аспекты должны быть рассмотрены для мониторинга завода подчеркивает , как засухи, например, в экофизиологических контексте. Например, потеря воды часто контролируется изменением свежей биомассы, что требует инвазивных TREatment растений , находящихся под следствием 5, например, рассекая лист. Вместо этого определения удельной теплоемкости, которая зависит от содержания воды в образце, в неинвазивным способом, как описано здесь, может быть использован в качестве суррогатного параметра для гидрацию растений. В обоих сценариях (фармацевтического производства и Экофизиология), искусственные напряжения, вызванные разрушительными или инвазивных методов измерения были бы вредны, поскольку они могут исказить экспериментальные данные. Таким образом, ранее сообщалось о способах Flash 6 или размещение образцов между серебряными пластинами 7 непригодны для таких процессов и экспериментов , поскольку они либо требуют непосредственного контакта с образцом или разрушительны. Параметры с р, s и λ должно быть определено с целью разработки технологического оборудования для бланширования шаг , который может упростить очистку продукта и тем самым снизить затраты на производство 8-10. Оба ср, s и λ могут теперь быть быстро определяется бесконтактным неразрушающим ближней инфракрасной области (БИК) лазерного зондирования последовательным и воспроизводимым способом 11 , и этот новый метод будет более подробно описано ниже. Результаты , полученные с помощью этого метода были успешно использованы для моделирования переноса тепла в листья табака 12, что позволяет конструкцию соответствующего технологического оборудования и выбор соответствующих параметров , таких как температура бланшировки.
Метод прост в настройке (Рисунок 1) и имеет две фазы, измерения и анализа, каждый из которых состоит из двух основных этапов. В измерении фазы, образец листа сначала локально нагревается коротким лазерным импульсом, а максимальная температура образца регистрируется. Профиль температуры образца затем записывается на протяжении 50-х годов. На этапе анализа, свойства листа, такие как плотность (легко и точно определяется пикнометрической measuremлор) в сочетании с максимальной температурой образца для расчета С р, с. На втором этапе, температурный профиль лист используется в качестве входных данных для уравнения баланса энергии, принимая проводимости, конвекции и излучения во внимание, чтобы вычислить Л.
Подробные инструкции шаг за шагом приведены в разделе протокола, расширение на содержание сопутствующего видео. Типичные измерения затем приведены в разделе результатов. И, наконец, преимущества и ограничения метода, выделены в разделе обсуждения наряду с потенциальными улучшений и дальнейшего применения.
Рисунок 1: Прибор используется для определения тепловых свойств листа. A. Фотография измерительного устройства используется для определения удельной теплоемкости и теплопроводности леAves. Периферийные устройства (компьютеры, осциллографов) не показаны. B. Схематическое изображение измерительного устройства. Лазер и подключенное оборудование, выделены красным цветом, детектор NIR для измерения температуры показана фиолетовым цветом, образец лист зеленый и датчик фотодиод мощности синего цвета. C. Нанесение элементов измерительной установки с тем же цветовым кодом, как и в B. Строка размер показывает 0,1 м. D. Снимок экрана, иллюстрирующий типичные элементы программного обеспечения управления лазером. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Растениеводство и подготовки образцов
- Промыть каждую шерсть блок минеральную с 1-2 л деионизированной водой и затем 1 л 0,1% [м / об] раствора удобрений. Поместите один табак (Nicotiana аЬасит или N. benthamiana) семян в каждом блоке и осторожно вровень с 0,25 л раствора удобрений без вымывания семян.
- Выращивают растения в течение 7 недель в теплице или фитотрон с 70% относительной влажности воздуха, 16-ч фотопериода (180 мкмоль s - 1 м - 2; λ = 400-700 нм) и 25/22 ° C свет / темнота температуры режим.
- Перемещение установки в устройство для измерения. Если растения неподвижны, урожай одиночные листья для измерения тепловых свойств.
2. Определить лист толщины и плотности
- Определить толщину листа
- Приготовьте 2% [/ v м] раствор агарозном в фосфатно-солевом буфере (PBS), иавтоклаве. Дают раствору остыть до 40 ° С и вставлять образец листа, помещенный в чашку Петри. Затвердеть агарозы путем размещения чашки Петри в холодильнике при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
- Вырезать агарозном блок в 200 мкм срезов с использованием vibratome с бритвенным лезвием под углом резания 15 °. Используйте скорость резания 1,0 мм · с -1 и амплитудой 0,5 мм.
- Маунт пять трансверсально листьев секции на предметном стекле с использованием Цианоакрилат в качестве закрепителя. Определить толщину листа под микроскопом с одной из целей 20 × и окуляр с 10-кратным увеличением, с помощью измерительных инструментов, встроенных в программное обеспечение микроскопа в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Определение толщины листа в выборочных зонах без жилок.
- В качестве альтернативы, определить толщину листа с коммутируемым датчика в области вены, свободной листовой пластинки. Убедитесь, что диск калибра проходит перпендикулярно к плоскости листовой пластинки.
обеспечения уплатыN: ЦИАНОАКРИЛАТ является раздражителем кожи, а также может склеить пальцы вместе, если не обращаться с осторожностью.
- Определить плотность листа
- Определить пустую массу (M 0) сухого пикнометра, а затем заполнить его водой и определить массу снова (M 1). Сушат пикнометра полностью, поместите лист внутрь и определить массу (м 2) еще раз. С листа внутри, тщательно заполнить пикнометра с водой и определяют массу (м 3).
- Вычислить плотность листьев (Ps) , используя уравнение 1.
Уравнение 1:
3. Определить спектральное пропускание и отражение Листья
- Поместите лист в образце камере UV / VIS спектрофотометра путем фиксации его между выборках холдинговая зажимами. Для измерений передачи, поместите лист перед йе Эктор. Для отражения измерений поместите лист на задней стенке камеры обнаружения.
- Запустите программу управления спектрофотометр. Выберите диапазон от 900 нм до 1600 нм. Начните новое сканирование и записать значения для передачи (μ Т) и отражения (μ R) , отображаемый UV / VIS спектрофотометр программного обеспечения на основе спектральной кривой.
- Выполните все измерения, по меньшей мере, трех биологических повторностях. Увеличение числа биологических повторностей до пяти или более , если неоднородное качество образца можно ожидать, то есть, изменение морфологии поверхности листа и толщины.
- Расчет мощности для передачи (P T) и отражения (P R) путем умножения измеренного х Т или мю значения R по измеренной мощности лазера P лазера в соответствии с уравнениями 2 и 3.
Уравнение 2:ftp_upload / 54835 / 54835eq2.jpg "/>
Уравнение 3:
Примечание: Передача может быть также определена с датчиком фотодиод во время измерения (см 6.3).
4. Настройка устройства для измерения
- Установите волоконно-в сочетании с одним бар NIR диодный лазер (длина волны = 1,550 нм) в конус диаметром 25,4 мм на держателе из нержавеющей стали. Подключение контроллера , чтобы установить выходную мощность (P лазер) БИК лазера до 4-6 Вт
- Поместите би-выпуклую линзу с фокусным расстоянием 25,4 мм в конце конуса для регулировки ширины луча до 13 мм.
- Поместите датчик мощности фотодиода 354 мм ниже нижней части линзы. Затем затухать фотодиода, помещая фильтр нейтральной плотности с оптической плотностью 1,0 и керамического слоя 22 мм над датчиком.
- Подключение датчика Фотодиод питания к осциллографу с помощью коаксиального кабеля.
- подключать10 × 10 см рама , которая имеет 6 × 6 см образец площадь экспозиции с помощью помосте измерительной установки на высоте 308 мм ниже объектива (рисунок 1). Зафиксировать положение листа в пространстве, устанавливая его в раме 10 см × 10.
- Подключите детектор NIR к персональному компьютеру с помощью кабеля универсальной последовательной шины (USB) и установить программное обеспечение интерфейса для детектора.
- Поместите детектор под углом 45 ° к лазерному лучу 135 мм над уровнем керамического слоя. Совместите область измерения детектора и лазерного пятна на образце путем изменения положения датчика и угла до тех пор, пока наблюдается максимальный сигнал температуры.
- С помощью программного обеспечения лазерного интерфейса управления для регулировки выходной мощности лазера до 5 Вт и длительность лазерного импульса до 0,5 сек. Выберите команду "Текущий контроль" в окне настроек управления, расположенные под графическим представлением мощности лазера и регулировать мощность лазера, набрав "5" в & #34; [Вт] Мощность ". Поле Регулировка длительности лазерного импульса, набрав" 0.5 "в" поле "Время [сек].
- Для определения абсолютной мощности лазера для каждой серии экспериментов, замените датчик фотодиод мощности с тепловой поверхностью поглотителя датчика мощности в конце каждой серии экспериментов и измерения выходной мощности лазера в течение 20 с без образца.
5. Подготовка пробы листьев
- Используйте неповрежденные и неповрежденные листья для измерений.
- Если уместно для исследования, имитируют типичные виды повреждения листьев, прокалывая лист с скальпелем, протирая лист между латексных перчаток, подвергая лист открытого пламени или лазерного луча на 2-3 сек, или использовать другие методы для моделирования других типы повреждений.
- Тщательно, но быстро смонтировать образец листа между образцом холдинговых зажимами.
6. Возьмите измерения температуры
- Избегайте прямого контакта между листом и керамикиаттенюатора расположен над датчиком фотодиод для предотвращения искусственного переноса тепла, мешающего с расчетом С р, с и X (смотри раздел 9).
- Используйте программное обеспечение для измерения температуры, чтобы собрать температурный профиль образца листа в общей сложности 60 с помощью детектора БИК. Во-первых, запись базового уровня температуры в течение 10 секунд, а затем активировать лазер в течение 0,5 с и продолжить сбор данных для 49,5 с.
- Начать измерение, нажав кнопку "Измерение", а затем "Новое измерение". После этого нажмите на зеленую стрелку над графическим представлением теплового профиля. Сохраните температурный профиль, нажав на иконку "Сохранить" (стилизованное диск) над графическим представлением профиля.
- Подтвердите переданный мощности лазера, используя датчик фотодиод мощности путем вычисления разности сигнала для измерений с образцом и без образца листа с помощью осциллографа, подключенногок датчику фотодиод питания через коаксиальный кабель (рисунок 2).
- Определить высоту двух флангах (F 1, S и F 2, S) в профиле напряжения , приобретенного с помощью осциллографа.
- Повторите измерение без образца листа в качестве эталона (F 1,0 и F 2,0). Рассчитать передачу М Т как отношение этих измерений в соответствии с уравнением 4 (смотри также рисунок 2).
Уравнение 4:
Рисунок 2: Измерение передачи листа с помощью датчика фотодиод мощности. A. Типичный профиль напряжения для опорного эксперимента без образца листа визуализированы с помощью осциллографа. B. профиль напряженияс образцом листа, установленного в устройстве. В обоих случаях, передаваемая мощность лазера пропорциональна каждой из двух боках. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
7. Вычислить удельная теплоемкость пробы листьев
- Рассчитать максимальную разность температур & Delta ; t [K] во время лазерного импульса путем вычитания комнатной температуры T 0 [K] от максимальной температуры листа Т ма х [K] (уравнение 5).
Уравнение 5:
- Вычислить энергию , поглощенную лист (E S [J]) на основе эффективной длительности импульса мощности лазерного излучения и лазерного (уравнение 6), где P R [W] является отраженная мощность лазера и P T [W] является переданный лазер мощность.
Equaние 6:
- Вычислить массу обогреваемой площади листа (м S [кг]) , используя уравнение 7, где d S [м] толщина листа в соответствии с 2.1), г Laser [м] радиус лазерного пятна, V S [ м 3] является объем нагретый лист, и ρ S [кг · м -3] плотность листьев в соответствии с 2.2).
Уравнение 7:
- Вычислить С р, s [Дж кг -1 К -1] в соответствии с уравнением 8 путем деления поглощенная энергия E S произведением площади листа массы т S с подогревом и максимальной разности температур & Delta ; t.
Уравнение 8:
8. Подготовка температуры профилей для изготовления Thermаль Проводимость Расчеты
- Используйте команду "Экспорт" программного обеспечения NIR управления датчиком для экспорта времени и температуры исходных данных в виде файла * .dat и открыть файл в процессоре электронных таблиц.
- Нанести 1: сокращение объема данных 100, например, с помощью "IF (MOD (значение; 100) = 0;" х "," 0 ")" команду, в результате чего плотность данных одной точки данных на 0,1 сек.
- Вычислить среднюю базовую температуру T B [° C] для каждого температурного профиля в течение первых 10 с после измерения, в течение которого лазер был еще выключен. Затем вычислить разность между T B и фактической температуры окружающей среды T 0 [° C].
- Используйте эту разницу индивидуально нормализовать каждый профиль, сдвигая его в сторону T 0 (у-нормализации), например, если T B - T 0 = 2,0 K, а затем вычесть 2,0 K из каждого значения температуры в температуре прOFILE (Фиг.3А).
- Нормализация временная координата каждого температурного профиля (х-нормализация), удалив каждую точку данных до максимальной температуры образца (Т макс) и присвоить новые значения времени , начиная с т = 0 при Т макс (рис 3B).
- Экран каждый профиль для резких температурных сдвигов, то есть температурные различия, которые более чем в три раза базовый уровень шума, который , как правило , 3 × 0,31 K ≈ 1,0 К. Удалить эти регионы из набора данных , поскольку они соответствуют измерению артефактов (рис 3C ).
- Установите экспоненциальную функцию затухания (уравнение 9) к данным с использованием процессора электронных таблиц, где T T [K] является встроенная температура листьев образца в момент времени T [с], T 0 температура окружающей среды, A [K] является амплитуда и т 1 [s] константа распада (рис3D).
Уравнение 9:
- С помощью подогнанной функции для расчета снижения температуры в образце листа от 0-80 сек после лазерного импульса.
- Преобразование данных , температура , измеренная в [° C] к [K] шкале путем добавления значения 273,15 до каждой точки данных температуры (рис 3Е).
Рисунок 3: Схема обработки данных для расчета Х. A. После восстановления данных, профили температуры нормированы по отношению к температуре окружающей среды. B. Далее, все точки данных перед максимальной температуры образца (Т макс) будут удалены. C. артефакты измерения (показано в "несогласованном" набор данных), идентифицируются в зависимости от температуры смещается больше, чем йРЗЭ раз базовый уровень шума и удалены из набора данных перед установкой к показательной функции. D. Шкала температуры по Цельсию превращается в шкале Кельвина. Е. Для каждого временного интервала, λ рассчитывается на основании температурного профиля. F. Окно 20 с определяется, в котором соответствующее изменение температуры можно наблюдать. G. На основе выбранного временного окна, среднее и стандартное отклонение рассчитываются при Х. H. Типичные результаты для двух различных образцов листьев N. аЬасит. Оранжевые стрелки и линии указывают на действие соответствующего этапа обработки на представленных данных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
9. Расчет теплопроводности образца Листа
- Вычислить температуру differeсть между образцом листьев и окружающей среды для каждого 0,1-секундного интервала в соответствии с уравнением 10, где & Delta ; t х [К] разность температур, T T [° С] насаженным температура листа образца и Т 0 [° C] температура окружающего воздуха (рис 3Е).
Уравнение 10:
- Предположим, что снижение температуры обусловлено совместным действием конвективного теплообмена, теплового излучения и теплопроводности. С помощью соответствующего энергетического баланса (уравнение 11) в качестве основы для вычисления X, где & Delta ; Е Temp [J] является разница в тепловой энергии образца в двух следующих друг за другом временных точках, & Delta ; Е радиан [J] , является разность энергии из - за теплового излучения, конв & Delta ; Е [J] является разность энергии за счет конвективного теплообмена, и Δ; Е Cond [J] , является разность энергии за счет теплопроводности.
Уравнение 11:
- Подставьте общие условия в энергетическом балансе с реальными физическими свойствами , приносящих Уравнение 12, где & Delta ; t T [K] является разница в наложенном температуры листьев образца, г на безразмерный коэффициент излучения, σ [кг s -3 K -4] Стефана -Boltzmann константа, рад [м 2] площадь теплового излучения, ч [Дж с -1 м -2 К -1] конвективный коэффициент теплопередачи, А конв [м 2] площадь конвективного теплообмена, А конд [м 2] площадь теплопроводности и л [м] характерной длины.
Уравнение 12:
- Вычислить чараcteristic длина л основана на корреляции: L = V / A.
- Используйте нагреваемый объем образца V S и площадь поперечного сечения образца листа для расчета [м 2]. Площадь поперечного сечения листа соответствует Cond в соответствии с уравнением 13, где Cond является областью , где происходит проводимость, г лазера радиус лазерного пятна и d s толщина листа.
Уравнение 13:
- Рассчитает и изл A CONV в соответствии с уравнением 14, где лазер площадь лазерного пятна.
Уравнение 14:
- Замену Уравнения 9, 12 и 13 в уравнение 11 и решить последний для X, дающую Уравнение 15 где т лазер тон длительность лазерного импульса [s].
Уравнение 15:
- Предположим , значение 0,94 для ε и вычислить Л для каждого интервала 0,1-s времени , в течение первых 20 с температурного профиля. Определяют среднее значение на 200 значений для Х , полученного таким образом , и вычислить стандартное отклонение (рис 3F - Н).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Измерение свойств листьев
Используя приведенный выше микроскопическим методом, толщина листа от 0.22-0.29 × 10 - 3 м была определена как для N. аЬасит (0,25 ± 0,04 × 10 - 3 м, п = 33) и Н. benthamiana (0,26 ± 0,02 × 10 - 3 м, п = 24), которая находится в пределах 0.20-0.33 × 10 - диапазон 3 м ранее для листьев различных видов растений 3. Определение толщины с помощью набора калибровочных дали значения ~ 0,28 × 10 - 3 м (п = 10), который был в пределах одного стандартного отклонения результатов от микроскопических измерений. Таким образом, измерение набора калибра может быть предпочтительным по сравнению с микроскопическим методом для определения толщины в обычных приложениях, как это было проще применять иРезультаты с P, S и ʎ отклонилась менее чем на 10% по сравнению с более трудоемкой техникой. Плотность Н. аЬасит и Н. листьев benthamiana составляла 750 ± 10 кг м - 3 (n = 20), который соответствует 631-918 кг м - 3 Диапазон ранее для листьев у других видов 3.
Расчет удельной теплоемкости
Температурные профили , собранные для вида Nicotiana показали стремительный рост в течение времени лазерного импульса и до максимальной температуры (Т макс) была достигнута в течение менее 1 с. После импульса, температуры экспоненциально уменьшается до тех пор, пока не достигнута температура окружающей среды (Т 0) (Фигура 3А - Е). Удельная теплоемкость (с р, з -1 К -1 для Н. аЬасит и 2252 ± 285 Дж кг -1 К -1 для Н. benthamiana. Два режима культивирования и длительностей использовались для каждого видов (смотри раздел 1.2) , но это не влияет на C P, S (рисунок 4). Тем не менее, с - р, клет уменьшилась линейно от старой (внизу) для молодых (сверху) листьев (R 2 = 0,85) в случае Н. аЬасит (фиг.4А), что коррелировало с содержанием воды [-1 гг биомасса] , которая была определена как разность влажной биомассы в момент сбора урожая и массы после 72 часов инкубации при 60 ° с 11. Эта корреляция между содержанием воды и удельной теплоемкости был в согласии с предыдущими наблюдениями других авторов 13. Обратная корреляция наблюдалась для Н. benthamiaпа (R 2 = 0,79), где разница между удельных теплоемкостей листьев различной степени зрелости (снизу = старцы; сверху = молодые) были лишь 13% по сравнению с 21% для N. аЬасит. Эта разница может возникать в том , что содержание воды в листьях N. benthamiana почти постоянна в течение различной степени созревания листа 11. Анализ чувствительности показал , что различия в С р, s были пропорциональны колебаниям параметров измерения в уравнении 8. Эффект отраженного и прошедшего мощность лазера была пропорциональна к югу, поскольку эти параметры не были индивидуальными факторами в уравнении 7. Соответственно, влияние ошибок в этих двух параметров был меньше, чем те, которые вызваны колебаниями мощности лазера или температуры окружающей среды. В общем случае , измерение считается надежным , поскольку все параметры , участвующих в вычислении С р, s имел коэффициентвариации менее 10% (Рисунок 4C и D).
Рисунок 4: Удельная теплоемкость и теплопроводность значения определяются для Н. аЬасит и Н. benthamiana. A. Удельная теплоемкость и теплопроводность Н. аЬасит листьев в соответствии с положением листьев на растении (кубовых = старых листьев; средний = зрелые листья, сверху = молодые листья). Звезды и треугольники обозначают растения, которые были 49 и 56 дней соответственно. B. Удельная теплоемкость и теплопроводность Н. benthamiana листьев в соответствии с положением листьев на растении. Звезды и треугольники обозначают растения, которые были выращены в фитотрон или оранжерее, соответственно. C. Чувствительность конкретных значений теплоемкости к изменениям входных параметров. Трiangles показывают конкретные значения теплоемкости в результате увеличения на 10% (красный, вверх) или уменьшение (синий, вниз) в параметрах единой модели. D. Чувствительность значений теплопроводности к изменениям входных параметров. Треугольники маркировать значения обувные теплопроводности в результате увеличения на 10% (красный, вверх) или уменьшение (синий, вниз) в параметрах единой модели. Столбики ошибок в A и B указывают стандартное отклонение (n ³ 3), в то время как в C и D они представляют собой полный диапазон значений, полученных при 10% анализа чувствительности вариации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Расчет теплопроводности
Теплопроводность (ʎ) рассчитывали из профилей температуры по экспоненциальнойфитинг (рисунок 3) в сочетании с уравнениями для проводящих и конвективного теплообмена, а также теплового излучения. Уравнение 15 дали средние значения 0,49 ± 0,13 J м - 1 с - 1 K - 1 (п = 19) для N. аЬасит и 0,41 ± 0,20 м J - 1 s - 1 K - 1 (п = 25) для N. benthamiana. Там не было никакой корреляции между ʎ и возраста растений или установления культивирования, хотя корреляция между возрастом и листьев ʎ наблюдалась Н. benthamiana (рис 4б), соглашаясь с ранее сообщенных возрастных различий в других видов растений 14. Как уже обсуждалось выше, содержание воды было маловероятно , причина этого различия , как это было установлено, что однородная по листьев различной зрелости для N. benthamiana. Вместо этого, мы предполагаем, что изменения в лт.в.ф. ткани, например, состав клеточной стенки, были ответственны за это наблюдение за счет изменения свойств теплопередачи листьев и тем самым влияя на величину ʎ. Определение ʎ был чувствителен к изменениям температуры окружающей среды. Анализ чувствительности показал, что колебания ± 2.3 K изменили значение ʎ на 64-125%. В соответствии с уравнением 15, температура окружающей среды оказывает влияние силой четырех на тепловое излучение и тем самым непосредственно влияет на величину ʎ.
Оценка устройства измерения
Удалось установить узел измерения в течение 3 ч. После того, как это было закончено, время запуска системы составляла приблизительно 15 мин на серии измерений. Одиночные измерения потребовалось менее 3 мин, в том числе подготовки проб и всего цикла измерений. Анализ времени лазерного облучения показало, чтоВремя нагревания 0,5 сек привело к увеличению температуры 19,9 ± 4,3 ° С (п = 55) был наилучший компромисс между высоким & Delta ; t (достигается за счет длинных лазерных импульсов) требуется для хорошего отношения сигнала к шуму (SNR) и низкая Delta ; t (достигается за счет коротких лазерных импульсов) требуется , чтобы избежать повреждения тканей. Длительностью импульса длиннее, чем 0,5 с приводит к потере массы из образца, вероятно, что отражает испарение воды и / или повреждение ткани листа, так как температура образца доходила до 70 ° С, в то время как только 42,9 ± 4,2 ° С (п = 55) наблюдались в течение 0,5 с лазерными импульсами. Для продолжительности не менее 0,5 с, шумовая температура ± 0,31 К (стандартное отклонение, N = 25) приходится более 5% & Delta ; t и , следовательно , была значительная часть & Delta ; t. В противоположность этому, на 0,5 с шумом составляли лишь 2,5% от сигнала и, таким образом, рассматривается как незначительный. Кроме того, образцы не нагреваются до более чем ~ 45 ° С, чтотемпературы , при которой растения табака также могут быть подвержены в естественном тропика к субтропической среды обитания и которая наносит вред только видов растений , найденных в тундре обитания 15. Плотность мощности лазера настраивалась на 170 кВт м -2, в то время как естественное солнечное излучение , как правило , в диапазоне 1,0-1,4 кВт м -2 16,17. Тем не менее, из - за очень короткое время импульса, эта более высокая доза энергии так , вероятно , не повредить ткани листа , как указано в недавно опубликованном микроскопического анализа 11. Температурные данные, используемые для расчета ʎ были ограничены к исходным через 20 с после лазерного импульса, так как только в этот период сделал шум (± 0,31 К) составляют менее 5% от сигнала температуры образца и, таким образом, рассматривается как незначительный. Когда использовались температурные данные за 20 сек временные рамки, значения , рассчитанные для ʎ снизилась (рис 3F). Возможное объяснение было то, что некоторые из предположенийсделано для расчета ʎ не применяются при низких значениях разности температур. В частности, термин, описывающий тепловое излучение в уравнении 15, возможно, были затронуты, поскольку это зависит от четвертой степени температуры. Кроме того , площадь листьев , окружающий пятно образец подвергается воздействию лазера может нагрелись немного и , таким образом , не могло бы быть идеальным теплоотвод в модели предполагается , уменьшая эффективную & Delta ; t х и в конечном счете вычисляемый ʎ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Бесконтактный, неразрушающий метод измерения описанный выше , может быть использован для определения С р, S и ʎ в одновременном и воспроизводимым образом. Расчет ʎ, в частности, зависит от нескольких параметров, которые чувствительны к ошибкам. Тем не менее, влияние этих ошибок было было обнаружено линейной или суб-пропорциональной, а коэффициент вариации для всех параметров, чтобы быть меньше, чем 10%. Даже при том, что метод таким образом, можно рассматривать как надежные, некоторые технические усовершенствования могут быть сделаны, чтобы уменьшить остальные источники ошибок.
Монтаж образца в сборку был технически сложной задачей, поскольку плоская поверхность листа является предпочтительным для измерения, но образец, естественно, имеет волнистую поверхность. Эту проблему можно решить путем создания специализированного держателя образца с геометрий точно подогнана к образцу листа, например, толщины и ширины листа, зажима образца в предпочитатьвозможность ориентации. Такой подход позволил бы сделать измерения более воспроизводимым, но может поставить под угрозу бесконтактный характер измерения, так как плотный контакт между образцом и держателем потребовалось бы, чтобы потянуть поверхность листа плоская. Таким образом, преимущества использования такого рода держателя , будет зависеть от контекста измерения, то есть, является ли наиболее важным точность или бесконтактный характер измерений. В отличие от этого , эти соображения не могут быть необходимы вообще для листьев с изначально плоской поверхности, например, риса и родственных видов.
Конвективный теплообмен за счет движения воздуха в окружающей среде образца должно быть сведено к минимуму во время измерений , так как это сильно влияет на вычисление как С р, с и ʎ 18. Поэтому аппарат должен располагаться вдали от воздушных потоков, генерируемых системами кондиционирования воздуха, радиаторы или другого оборудования, таких как компьютер синтегральные вентиляторы охлаждения. Это также имеет важное значение , так как изменения относительного содержания воды в листьях 19 , которые могут возникнуть до или во время измерения из - за испарения, которую можно увеличить с помощью воздушных движений 20, не были учтены в модели. Таким образом, измерения, особенно с отсоединением листьев, следует проводить быстро, как это описано в разделе протокола, чтобы избежать ошибок во время сбора данных. В будущем, эффекты испарения на измерении можно уменьшить или избежать, если измерение проводят в по меньшей мере частично закрытую емкость измерительной камеры с реализованного контроля влажности.
Точность С р, с и ʎ значений может быть увеличена путем измерения параметров , используемых в соответствующих уравнений более точно. В случае С р, s эти параметры мощности лазера, максимальный и температуры окружающей среды и образца объем, то есть произведение LASэр площадь пятна и толщину и плотность образца (уравнение 8). Последние два параметра должны быть определены в экспериментах, сопровождающих фактическое измерение и их надежность может быть повышена, если тестируются несколько репрезентативных биологических повторностях. Тем не менее, даже при использовании простой измерения коммутируемого колеи, разница в толщине листа по сравнению с микроскопическим анализом было только 11%, что отразилось на значения , рассчитанные для C P, S и ʎ той же степени. В отличие от этого, температуры и мощности лазера можно контролировать в течение всего измерения. Точность С р, s может быть улучшена , если эти оперативные данные используются вместо фиксированных значений для мощности лазера и температуры окружающей среды, а также данные собираются с использованием хорошо калиброванных датчиков. Эти соображения также применимы к ʎ, но температура окружающей среды и температурах образца являются наиболее важными параметрами, поскольку оба влияют на расчетную величину силой четырех.
В настоящее время расчет ʎ был основан на нескольких предположениях относительно конвективного теплообмена и теплового излучения. Например, коэффициент излучения (ε) и коэффициент конвективной теплоотдачи (ч) не были измерены или вычислены в явном виде в способе , представленном выше, но были получены из предыдущих публикаций 18,21. Таким образом, точность ʎ может быть улучшена путем определения этих двух параметров в реальных условиях измерения. Однако, используя литературные данные для расчетов , тем не менее дали ʎ значения , которые были в пределах диапазона экспериментально определенной для других видов растений , для которых можно ожидать аналогичные свойства из - за их филогении к видам Nicotiana и их физиологии, т.е. травянистых растений 3. Даже если значения ε и ч варьировали во всем диапазоне сообщалось ранее для этих значений в растениях, например, 0.93-0.98 для е 21, их влияние на конечное значение ʎ составила <10% и , таким образом , в пределах естественной изменчивости наблюдаемых здесь.
Метод, представленный выше, не только смог определить тепловые свойства интактных невредимым листьев и отдельных листьев, но и правильно определены различные типы более серьезного повреждения введенного преднамеренно перед измерением. Таким образом, различные типы образцов листьев, можно легко отличить, обеспечивая инструмент для удаления, перед анализом, развивающуюся образцы, которые дали бы данные низкого качества. Эта функция может быть использована для контроля качества при мониторинге биологических материалов, например, образцы не отвечающие спецификациям с точки зрения с P, S и ʎ могут быть исключены из дальнейшей обработки. Это будет активом в контексте высокоактивного регулируемых процессов , таких как молекулярная земледелии 4.
Преимущества этого нового метода по сравнению с другими вв литературе включают быстрое обращение с пробами, минимальной подготовки, бесконтактный и неразрушающий одновременное измерение С р, с и ʎ, а также использование общего оборудования , которые можно найти во многих оптических лабораториях. Это будет способствовать расширение сферы применения метода по сравнению с теми, требующих специальных и дорогих устройств, таких как дифференциальные калориметры сканирования. Кроме того, калориметрия требует непосредственного контакта с образцом 22 , так что существует риск повреждения, и способ обычно ограничивается измерением удельной мощности 22 тепла. В противоположность этому , в то время как тепловидения может обнаружить некроз или физические изменения в листьях или целых растений в бесконтактной форме 23, она также требует комплексного анализа изображения и выделенные специализированные устройства 24 , которые могут быть преодолены в будущем более дешевыми и более мощными ИК - камер и сопутствующие периферийные устройства. Спектральный анализ еще один контакт-птМетод эи для анализа содержания воды и уровней хлорофилла 25, но он еще не был использован для определения удельной теплоемкости и / или теплопроводности.
Подход измерения сообщаемые здесь является надежным методом определения тепловых свойств листьев растений с низкими затратами инвестиционных и малое время измерения. Она была успешно использована для определения С р, S и ʎ в Н. аЬасит и Н. benthamiana, два вида , которые имеют существенное значение в области молекулярного сельского хозяйства 4. Значения , рассчитанные для обоих параметров на основе профилей температуры листа были в хорошем согласии с ранее для других видов растений 3. Метод является неразрушающим, без контакта, и не требует сложной подготовки образцов, обеспечивая преимущества перед всеми текущими альтернативными методами для анализа тепловых свойств. Простая конструкция может также способствовать развитию ручной ХельD устройства для повышения гибкости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" tube | Thorlabs | SM1L10E | Tube for fiber holder |
| Agarose | Sigma Aldrich | A0701 | Agarose |
| Bi-Convex lense f=25.4 | Thorlabs | LB1761 | Lense |
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | Thorlabs | PM100D | Console for thermal surface absorber sensor |
| Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO7104 | Oscilloscope |
| DMR light microscope | Leica | n.a. | Light microscope |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-2 | Pycnometer |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Fiber holder | Thorlabs | Fiber holder | |
| Forma -86 °C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Infrared Detector Optris CT | Optris | OPTCTLT15 | Infrared detector |
| Infrared Detector Software Compact Connect | Optris | n.a. | Control software for infrared detector |
| Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer | PerkinElmer | L1050 | UV/VIS Spectrophotometer |
| Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module | DILAS | M1F-SS2.1 | Laser |
| Laser cover | Amtron | LM200 | Laser Cover |
| Laser Driver | Amtron | CS 408 | Laser Driver |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Photodiode sensor | Thorlabs | PDA20H-EC | Power sensor for transmission measurements |
| Precision weight Ohaus Analytical Plus | Ohaus | 80251552 | Precision weight |
| Sample frame | Fraunhofer ILT | n.a. | Fixation of the leaf sample |
| Software Pyro Control | Amtron | n.a. | Laser Power Control Software |
| Stainless-steel-holder | n.a. | n.a. | Holder for measurement set-up |
| Teflon plates 2 cm | Fraunhofer ILT | n.a. | Teflon attenuation |
| Thermal surface absorber Power sensor | Thorlabs | S314C | Sensor for laser power measurements |
| Vibratome | Leica | 1491200S001 | Vibratome |
| Zoc/Pro 6.51 | EmTec Innovative Software | n.a. | Laser Control Software |
References
- Wilhelm, E. Heat Capacities: Liquids, Solutions and Vapours. , Royal Society of Chemistry. 516 (2010).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. J. Exp. Bot. 64, 3937-3949 (2013).
- Jayalakshmy, M. S., Philip, J. Thermophysical Properties of Plant Leaves and Their Influence on the Environment Temperature. International Journal of Thermophysics. 31, 2295-2304 (2010).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Schuster, A. C., et al. Effectiveness of cuticular transpiration barriers in a desert plant at controlling water loss at high temperatures. AoB PLANTS. 8, (2016).
- Parker, W. J., Jenkins, R. J., Abbott, G. L., Butler, C. P. Flash Method of Determining Thermal Diffusivity, Heat Capacity, and Thermal Conductivity. J Appl Phys. 32, 1679-1684 (1961).
- Hays, R. L.
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer, R. Blanching intact leaves or heat precipitation in an agitated vessel or heat exchanger removes host cell proteins from tobacco extracts. J. Vis. Exp. , Under review (2015).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Tödter, N., Wehner, M. Determination of the thermal properties of leaves by non-invasive contact free laser probing. J. Biotechnol. 217, 100-108 (2016).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Hedlund, H., Johansson, P. Heat capacity of birch determined by calorimetry: implications for the state of water in plants. Thermochim Acta. 349, 79-88 (2000).
- Chandrakanthi, M., Mehrotra, A. K., Hettiaratchi, J. P. A. Thermal conductivity of leaf compost used in biofilters: An experimental and theoretical investigation. Environ. Pollut. 136, 167-174 (2005).
- Larcher, W. Physiological Plant Ecology: Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups. , Springer Science & Business Media. (2003).
- Cowen, R. A gamma-ray burst's enduring fireball. Science News. 152, 197 (1997).
- Jones, H. G., et al. Thermal infrared imaging of crop canopies for the remote diagnosis and quantification of plant responses to water stress in the field. Funct. Plant Biol. 36, 978-989 (2009).
- Defraeye, T., Verboven, P., Ho, Q. T., Nicolai, B. Convective heat and mass exchange predictions at leaf surfaces: Applications, methods and perspectives. Comput. Electron. Agric. 96, 180-201 (2013).
- Arndt, S. K., Irawan, A., Sanders, G. J. Apoplastic water fraction and rehydration techniques introduce significant errors in measurements of relative water content and osmotic potential in plant leaves. Physiol. Plant. 155, 355-368 (2015).
- Jones, H. G., Schofield, P. Thermal and other remote sensing of plant stress. General and Applied Plant Physiology. 34, 19-32 (2008).
- Jones, H. G., Archer, N., Rotenberg, E., Casa, R. Radiation measurement for plant ecophysiology. J. Exp. Bot. 54, 879-889 (2003).
- Dupont, C., Chiriac, R., Gauthier, G., Toche, F. Heat capacity measurements of various biomass types and pyrolysis residues. Fuel. 115, 644-651 (2014).
- Chaerle, L., et al. Multi-sensor plant imaging: Towards the development of a stress-catalogue. Biotechnol. J. 4, 1152-1167 (2009).
- Hackl, H., Baresel, J. P., Mistele, B., Hu, Y., Schmidhalter, U. A Comparison of Plant Temperatures as Measured by Thermal Imaging and Infrared Thermometry. J. Agron. Crop. Sci. , 415-429 (2012).
- Yuan, L., et al. Spectral analysis of winter wheat leaves for detection and differentiation of diseases and insects. Field Crops Res. 156, 199-207 (2014).
