Observation et Quantification de Mating Comportement dans le nématode,<em> Bursaphelenchus xylophilus</em
Summary
A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.
Abstract
Une méthode d'observation et de quantifier le comportement d'accouplement du nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, a été créé sous un stéréomicroscope. Pour améliorer l'efficacité de l' accouplement de B. Xylophilus et d'augmenter les chances d'observation de l' accouplement, les adultes vierges ont été cultivées et utilisées pour l'enquête. Les œufs ont été obtenus en gardant les nématodes dans l'eau et en permettant aux femelles à pondre des oeufs pendant 10 min. Les juvéniles de deuxième stade (J2) ont été synchronisées par incubation des oeufs pendant 24 h à 25 ° C dans l'obscurité, et le début du J4 ont été obtenus en cultivant le J2 avec de la moisissure grise, Botrytis cinerea, pour un autre 52 h. A ce point du temps, la plupart des nématodes J4 pourraient être clairement distingué comme étant un homme ou une femme en utilisant leur morphologie génitale. Le mâle et la femelle J4 ont été recueillies et cultivées séparément dans deux plats différents de Pétri pendant 24 h pour obtenir nématodes adultes vierges. Un mâle et une femelle vierge vierge ont été jumelés dans une goutte de water dans le puits d'une lame concave. Le comportement d'accouplement a été filmé avec un enregistreur vidéo sous un stéréomicroscope. Toute la période du processus d'accouplement était de 82,8 ± 3,91 min (moyenne ± SE) et pourrait être divisé en 4 phases différentes: la recherche, contact, copuler et persistants. Les minutes moyennes de durée étaient de 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 et 7,2 ± 0,5, respectivement. sous-comportements Onze ont été décrits: croisière, approche, rencontrer, toucher, frettage, la localisation, la fixation, éjaculer, séparer, quiescence, et l'itinérance. Fait intéressant, la concurrence intra-sexuelle évidente a été observée lorsque une femme a été regroupé avec 3 mâles ou d'un mâle avec 3 femelles. Ce protocole est utile et précieux, non seulement dans l' étude du comportement d'accouplement de B. xylophilus, mais aussi en agissant comme une référence pour les études éthologiques des autres nématodes.
Introduction
The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity.
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les tests comportementaux sont un aspect fondamental de l'écologie chimique, la neurobiologie, la biologie moléculaire et la génétique. Nématodes, et en particulier C. elegans, sont largement utilisés pour des études dans ces domaines. Le comportement d'accouplement de C. elegans a été étudiée précédemment 10-11. Cependant, B. xylophilus est gonochorique et différent des C. elegans hermaphrodites, et son processus d'accouplement a différentes cara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najie Zhu Liqun et Bai ont contribué également à ce travail. Ce travail a été soutenu financièrement par le Fonds spécial pour la recherche forestière scientifique dans le bien-être public (201204501) et la National Natural Science Foundation de Chine (31170604, 31270688 et 31570638). Nous remercions le Dr Holighaus Gerrit et la Dre Danielle Hickford pour leurs suggestions utiles sur l'anglais écrit.
Materials
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121°C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen’s mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R. Male mating behaviour. The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
