Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro,<em> Bursaphelenchus xylophilus</em
Summary
A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.
Abstract
Um método para observar e quantificar o comportamento de acasalamento do nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, foi criada sob microscópio estereoscópico. Para melhorar a eficiência de acoplamento de B. Xylophilus e aumentar as chances de observação de acasalamento, os adultos virgens foram cultivadas e utilizadas para a investigação. Os ovos foram obtidas, mantendo os nemátodos em água e permitindo que as fêmeas a pôr ovos durante 10 min. Os juvenis de segundo estádio (J2) foram sincronizadas por incubação dos ovos durante 24 h a 25 ° C no escuro, e o início J4 foram obtidos por cultura do J2 com bolor cinzento, Botrytis cinerea, por outro 52 h. Neste ponto do tempo, a maioria dos nematóides J4 podia ser claramente distinguida como sendo do sexo masculino ou feminino com sua morfologia genital. O macho e fêmea J4 foram recolhidas e cultivadas separadamente em dois pratos de Petri diferentes durante 24 h para obter nemátodos adultos virgens. Um macho e uma fêmea virgem virgem foram emparelhados em uma gota de watER no poço de uma lâmina côncava. O comportamento de acasalamento foi filmado com um gravador de vídeo sob microscópio estereoscópico. todo o período do processo de acasalamento foi de 82,8 ± 3,91 min (média ± SE) e pode ser dividido em 4 fases distintas: pesquisa, contactando, copulando, e remanescentes. Os médios minutos de duração foram 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 e 7,2 ± 0,5, respectivamente. Onze sub-comportamentos foram descritos: cruzeiro, aproximando-se, encontrando, tocando, hooping, localizar, prender, ejacular, separar, quietude, e roaming. Curiosamente, óbvia a concorrência intra-sexual foi observada quando uma fêmea foi agrupada com 3 machos ou um macho com 3 fêmeas. Este protocolo é útil e valioso, não só na investigação do comportamento de acasalamento de B. xylophilus, mas também em atuar como referência para estudos etológicas dos outros nematóides.
Introduction
The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity.
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os testes comportamentais são um aspecto fundamental da ecologia química, neurobiologia, biologia molecular e genética. Nematóides e, em particular C. elegans, são usados extensivamente para estudos nessas áreas. O comportamento de acasalamento de C. elegans foi investigada anteriormente 10-11. No entanto, B. xylophilus é gonochoristic e diferente dos hermafroditas C. elegans, e seu processo de acoplamento tem diferentes características comportamentais 9.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najie Zhu e Liqun Bai contribuíram igualmente para este trabalho. Este trabalho foi financiado pelo Fundo Especial para Pesquisa Científica Florestal na Public Welfare (201204501) ea National Science Foundation Natural da China (31170604, 31270688 e 31570638). Agradecemos ao Dr. Holighaus Gerrit e Dr. Danielle Hickford por suas sugestões úteis sobre Inglês escrito.
Materials
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121°C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
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