Observation och kvantifiering av parningsbeteendet hos tallvedsnematoden,<em> Bursaphelenchus xylophilus</em
Summary
A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.
Abstract
En metod för att observera och kvantifiera parningsbeteende tallvedsnematoden, Bursaphelenchus xylophilus, bildades under ett stereomikroskop. För att förbättra den passande effektivitet B. Xylophilus och öka chanserna för parning observation, jungfru vuxna odlades och användes för undersökningen. Ägg erhölls genom att hålla nematoderna i vatten och gör det möjligt för kvinnor att lägga ägg under 10 min. De andra Stadium (J2) synkroniserades genom inkubation av ägg för 24 timmar vid 25 ° C i mörker, och den tidiga J4 erhölls genom odling av J2 med gråmögel, Botrytis cinerea, för ytterligare 52 timmar. Vid denna tidpunkt, kan de flesta J4 nematoder vara klart åtskilda som manliga eller kvinnliga använda sina könsorgan morfologi. Den manliga och kvinnliga J4 samlades och odlades separat i två olika petriskålar under 24 timmar för att få jungfru vuxna nematoder. En jungfru hane och en jungfru kvinnliga parades i en droppe water i brunnen av en konkav slid. Parningsbeteende filmades med en videokamera under ett stereomikroskop. Hela perioden av parningsprocessen var 82,8 ± 3,91 min (medelvärde ± SE) och kan delas in i 4 olika faser: sökning, kontakt, kopulerande och kvardröjande. De genomsnittliga minuters varaktighet var 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 och 7,2 ± 0,5, respektive. Elva under beteenden beskrevs: cruising, närmar sig, möter, röra, förena, lokalisera, fästa, utlösning, separering, passivitet, och roaming. Intressant nog var uppenbart inom sexuell konkurrens observerades när en hona grupperades med 3 hanar eller en hane med 3 tikar. Detta protokoll är användbar och värdefull, inte bara för att utreda parningsbeteende B. xylophilus, men även att agera som en referens för etologiska studier av andra nematoder.
Introduction
The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity.
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beteendetester är en grundläggande aspekt av kemisk ekologi, neurobiologi, molekylärbiologi och genetik. Nematoder, och särskilt C. elegans, används i stor utsträckning för studier i dessa områden. Den parningsbeteende av C. elegans har undersökts tidigare 10-11. Emellertid är B. xylophilus gonochoristic och skiljer sig från de hermafroditiska C. elegans, och dess parning process har olika beteendefunktioner 9. Nyligen var parningsbeteende Bursaphe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najie Zhu och Liqun Bai bidragit lika för detta arbete. Detta arbete stöds ekonomiskt av den särskilda fonden för skogs vetenskaplig forskning i den offentliga välfärden (201204501) och National Natural Science Foundation i Kina (31170604, 31270688 och 31.570.638). Vi tackar Dr Holighaus Gerrit och Dr. Danielle Hickford för deras användbara förslag på engelska skrift.
Materials
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121°C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen’s mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R. Male mating behaviour. The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
