زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية الإنسان (hMSCs) مع مصل ذاتي، ويقلل من مخاطر رفض المواد xenogeneic والآثار السلبية الأخرى. كما يسمح لاسترداد مجموعة فرعية من الأسلاف أرومية متوسطة، الذي يمكن أن يحقق hMSCs جديدة. تضمين hMSCs في تجلط الليفين ذاتي يتيح سهولة التعامل وغرس الجراحي الفعال.
الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية الإنسان (hMSCs) يتم تربيتها في المختبر مع وسائل الإعلام المختلفة. قيود على استخدامها في المرافق الصحية، ومع ذلك، تعتمد أساسا على مخاطر بيولوجية والتهاب محتملة من قبل العناصر الغذائية xenogeneic لثقافتهم المبذولة. المشتقات الإنسان أو مواد المؤتلفة هي المرشحين الخيار الأول للحد من هذه التفاعلات. لذلك، وملاحق والمواد من أصل ذاتي الثقافة تمثل أفضل المواد الغذائية والمنتجات الأكثر أمانا.
هنا، نحن تصف بروتوكول جديد للعزلة وثقافة hMSCs نخاع العظام في ظروف ذاتي – أي مصل المستمدة من المريض بمثابة تكملة لمستنبت والفيبرين بمثابة سقالة لإدارة hMSC. في الواقع، يمكن أن يكون hMSC بنيات / الفيبرين تجلط مفيد للغاية في العديد من التطبيقات السريرية. على وجه الخصوص، ونحن نركز على استخدامها في جراحة العظام، حيث جلطة الفيبرين المشتقة من الدم المتبرع نفسه سمحتتسليم خلية فعالة والمغذيات / النفايات التبادلات. لضمان شروط السلامة المثلى، فإنه من الأهمية بمكان لتجنب مخاطر hMSC التحول وفرط الأنسجة. لهذه الأسباب، فإن النهج الوارد وصفها في هذه الورقة يشير أيضا خارج الحي hMSC التوسع الحد الأدنى، للحد من الشيخوخة الخلوية والتغييرات الشكلية، وعلى المدى القصير أستيو تمايز قبل الزرع، للحث على مواصفات النسب المكونة للعظم، مما يخفض من خطر الإصابة اللاحقة غير المنضبط تكاثر.
خلايا الإنسان الجذعية الوسيطة اللحمية (hMSCs) تمثل واحدة من أفضل مصادر الخلايا لاستخدامها في هندسة الأنسجة لتعزيز تكون العظم 1،2. يتم عزل أنهم بسهولة من نخاع العظام والأنسجة الكبار الآخرين، والتعبير عن علامات سطح نموذجية مثل CD90، CD105، CD73 1. وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن أن تفرق في عدة أنواع الخلايا، مثل بانيات، غضروفية والخلايا الشحمية 3. وتعزى الآثار العلاجية لالتجدد وممتلكاتهم الغذائية (4). ويمكن استخدام hMSCs في جراحة العظام، وكذلك في التطبيقات السريرية التجدد أخرى. وقد تم الجمع بينها ويفضل مع السقالات، من أجل تحسين النتائج السريرية 5.
بالمقارنة مع غيرها من المواد، ويظهر هلام الليفين العقارات المميزة مثل الإلتصاق، ارتشاف ونقل فعالة من المواد المغذية، مما يجعلها مفيدة للغاية لمجموعة متنوعة من التطبيقات هندسة الأنسجة 6،7.
<p cمعشوقة = "jove_content"> ويتمثل التحدي الرئيسي في ترجمة نهج هندسة الأنسجة في التطبيقات السريرية والحصول على سقالة بالكامل حيويا وBIOSAFE والمتوسطة ثقافة خالية من XENO أن يتجنب أي تأثير عدوى أو رد الفعل.في أسلوبنا، هلام الليفين، والمستمدة من دم المريض نفسه، ومصل ذاتي، لفي المختبر hMSCs الثقافة، كانوا يعملون كحل علاجي ممكن في مجال جراحة العظام 8.
لأغراض السريرية، وتدار hMSCs عادة عن طريق إجراءين رئيسيين: (ط) "خطوة واحدة" الإجراء (أي الحد الأدنى التلاعب)، الذي يسمح للزرع السيارات من نخاع العظم، إما كليا أو مركزة (أي الخلايا وحيدات النوى)، أثناء الجراحة. و (ثانيا) "خطوتين" الإجراء (أي تلاعب واسع)، والتي تقوم على التوسع المجراة سابقا من hMSCs لزيادة انتاجها قبل الزرع، ويتطلب Gمرافق النائب 9. ومن المثير للاهتمام، زراعة الخلايا مع المصل الكبار البشري بدلا من مصل العجل البقري يسمح للانتعاش، جنبا إلى جنب مع hMSCs، من مجموعة فرعية من الخلايا (1-10٪ في الثقافات وحيدات النوى) تسمى خلايا أرومية متوسطة السلف (البلدان المتوسطية الشريكة)، قادرة على التمايز في المختبر إلى طازجة hMSCs 10،11. وبالتالي، قد hMPCs تلعب دورا هاما في عملية التجدد بالمقارنة مع hMSCs وحدها 12،13. وأخيرا، على المدى القصير أستيو الاستقراء يدفع hMSCs لبدء المفاضلة الخاصة بهم في النسب عظمي المنشأ دون أن تفقد التكاثري إمكاناتهم وقدرتها على البقاء 12. هذه النتائج تؤكد الدراسات السابقة التي أبلغت المعززة في تكوين العظام المجراة من قبل hMSCs، تليها preculture في المتوسط عظمي المنشأ 14. وعلاوة على ذلك، وهو تجلط البلازما ذاتي كما سقالة لتسليم خلية يمكن التلاعب بها بسهولة من قبل الجراح ومصبوب لتناسب شكل العظام تجويف 13.
عشرerefore، يمكن أن يكون هذا الأسلوب مفيدا للغاية بالنسبة لأولئك الباحثين والأطباء الذين يهدفون إلى ترجمة علاجهم استنادا hMSC-من مقاعد البدلاء إلى السرير في تطبيقات العظام.
الخطوات الحاسمة من هذا القلق البروتوكول استخدام مصل الكبار البشري والبروتيني، والتي تسمح للحصول على BIOSAFE hMSC العلاج. على وجه الخصوص، ومصل الكبار البشري يمكن العزلة والصيانة، في حين البروتيني يضمن الحصاد، من البلدان المتوسطية الشريكة. هذه هي خلايا غير ناضجة الموجودة في نخاع العظام التي يمكن أن تؤدي إلى hMSCs جديدة، وبالتالي ضمان خزان hMSCs قابلة للحياة على طول الوقت ثقافة. ليست كل البلدان المتوسطية الشريكة التي يمكن جمعها، لأن زيادة فترة التعرض لنشاط الأنزيم البروتيني غير ضارة لبقاء hMSC. لهذا السبب، تم اختيار البروتيني حضانة 10 دقيقة كما سطا الأمثل بين الانتعاش من البلدان المتوسطية الشريكة وصلاحية hMSCs. خطوة حاسمة أخرى هي المرة osteodifferentiation. في الواقع، فإن وجود واسعة النطاق في osteodifferentiation المختبر لحد كبير بقاء الخلية، مما يؤثر على تكوين العظام النهائي في الجسم الحي. الخطوة الأخيرة الفاصلة تتمثل في النفع من سقالة bioresorbable ذاتي، حركتييتم الحصول على ساعة عن طريق دمج الخلايا (hMSCs والبلدان المتوسطية الشريكة) في جل الليفين من تخثر البلازما.
خطوة رئيسية لتعزيز العائد من البلدان المتوسطية الشريكة هي البذور خلايا وحيدة النواة في التركيز العالي. باستخدام إجراءات فصل مكونات الدم للحصول على البلازما والتعامل معها مع غلوكونات الكالسيوم يجعل من الممكن لتحقيق مصل ذاتي في كميات كبيرة. وقد لوحظ أن المصل البشري كمكمل المتوسط يماثل الجنين مصل بقري (FBS) في الثقافات hMSC. ومع ذلك، في تجربتنا، والمتوسطة كاملة تستكمل مع FBS يساهم في الشيخوخة أسرع من مصل الكبار البشري. خطوة هامة هي أن المتمثلة في إدارة osteoinduction الحد الأدنى لhMSCs. في الواقع، وهذا العلاج يؤدي الخلايا التفريق بسهولة نحو النسب عظمي المنشأ، وبالتالي كونها مفيدة لتجنب المزيد من تحول الخلايا في الجسم الحي. للحفاظ على استمرارية جيدة من hMSCs osteoinduced الحد الأدنى، فمن المستحسن أن تتبع بدقة توصيات موضح في الخطوات 6.5. لد 8.2، بما في ذلك التعامل، الطرد المركزي وكميات متوسطة إلى أن تضاف. إذا كان الإجراء فصادة غير متوفر، فإنه لا يزال من الممكن تنفيذ هذا البروتوكول عن طريق أداء الدم عدة مرات توجه للمريض، أو في البديل، من خلال شراء المجمعة AB الأمصال. من الواضح، من أجل تحقيق هذا البروتوكول من السرير مقاعد البدلاء ل، وهو إلزامي لدينا مصانع خلية برنامج الرصد العالمي، أو ما يعادلها، والمتاحة.
قيود على تطبيق هذه التقنية القلق فقر الدم، أمراض الدم، الأورام ومرضى العظام المتضررة من التهاب العظم والنقي.، رسم كميات كبيرة من الدم من مرضى فقر الدم، وينبغي تجنبها. في المرضى الذين يعانون الأورام، ونوعية العينات خلية تتأثر العلاج الكيماوي، بينما في المرضى الذين يعانون التهاب العظم والنقي العدوى يمكن أن تؤثر على النتيجة النهائية. في جميع الحالات التي يكون فيها المصل ذاتي غير كاف أو غير مناسب، ذكر المجمعة AB الأمصال تمثل بديلا جيدا.
باستخدام خلية / الفيبرين اومهر يبني لالتطبيقات السريرية المحتملة هي حاسمة للافراج عن العلاج بالخلايا ذاتي تماما، والتي يمكن أن يكون من السهل التعامل معها والعفن أثناء الجراحة، مما أدى إلى نتائج ممتازة لعلاج العظام غير النقابات-13. لأغراض السريرية، وعادة ما تدار hMSCs عبر إجراءين رئيسيين: الحد الأدنى من التلاعب والتلاعب واسعة النطاق 9. للتغلب على المشاكل المتعلقة ثقافة واسعة خارج الجسم، مثل تشوهات في شكل الخلية وحجم 18، أجرينا وقت قصير فيفو السابقين توسيع الخلايا وأستيو تمايز (4 د فقط).
بروتوكول خالية من XENO صفها في هذه الورقة، جنبا إلى جنب مع توسيع الخلية وosteodifferentiation أوقات قصيرة، أثبتت أن تكون ذات صلة في العيادات من أجل الحصول على إنتاج العظام سريع في الجسم الحي، دون وجود أدلة من فرط الأنسجة والتحول، مما يؤكد فعالية ومنذ فترة طويلة سلامة الاجل في إصلاح العظام (الشكل 5) </stroنانوغرام> 13.
وتهدف هذه المنهجية الواردة في هذا التقرير في مما يدل على فعالية وسلامة hMSC في توسيع المختبر في ظروف ذاتي لاستخدامها المحتمل في جراحة العظام. يستخدم هذا البروتوكول hMSCs معزولة عن نخاع العظام والمثقف في المتوسط تستكمل مع مصل ذاتي وجزءا لا يتجزأ من جلطة الفيبرين ذاتي، وبالتالي ضمان العلاج بالخلايا ذاتي تماما. تحريض عظمي المنشأ شقين، قبل مفرزة الثانية، ويحسن hMSC القدرة على التمايز إلى خلايا بناء العظم. ونتيجة لذلك، فإن هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة للتطبيقات في عيوب العظام، لأنه لا يقتصر على المفصل الموهم. يمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية المحتملة الكيس الكاحل وإدارة فقدان العظام.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.
Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
DMEM-LG, no glut, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
Glutamax (100X) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
Penicillin Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
Microtome | Leika | histological assay | |
May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |