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Bioengineering

Mesenchymal stromal सेल संस्कृति और ऑटोलॉगस शर्तों में डिलिवरी: आर्थोपेडिक अनुप्रयोगों के लिए एक स्मार्ट दृष्टिकोण

Published: December 8, 2016 doi: 10.3791/54845
Automatic Translation
1,2, 2,3, 4, 1, 2,5, 2, 6, 1
1Dept. of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa, 2OtoLab, Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana (AOUP), 3Dept. of Civil and Industrial Engineering, University of Pisa, 4Immunohematology Operative Unit, Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana (AOUP), 5Dept. Of Surgical, Medical, Molecular Pathology and Emergency Medicine, University of Pisa, 6II Orthopedic and Traumatologic Clinic, Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana (AOUP)

Summary

ऑटोलॉगस सीरम के साथ मानव mesenchymal stromal कोशिकाओं (hMSCs) संवर्धन, xenogeneic सामग्री और अन्य नकारात्मक प्रभाव से अस्वीकृति का जोखिम कम करता है। यह भी mesodermal progenitors के एक सबसेट है, जो ताजा hMSCs वितरित कर सकते हैं की वसूली के लिए अनुमति देता है। एक ऑटोलॉगस आतंच थक्का में hMSCs एम्बेड आसान हैंडलिंग और प्रभावी शल्य आरोपण सक्षम बनाता है।

Abstract

मानव mesenchymal stromal कोशिकाओं (hMSCs) विभिन्न मीडिया के साथ इन विट्रो में सुसंस्कृत हैं। नैदानिक ​​सेटिंग में उनके उपयोग की सीमाएं हैं, हालांकि, मुख्य रूप से अपनी संस्कृति के लिए xenogeneic पोषक तत्वों द्वारा लगाए गए संभावित biohazard और सूजन जोखिम पर निर्भर करते हैं। मानव डेरिवेटिव या पुनः संयोजक सामग्री पहली पसंद के उम्मीदवारों को इन प्रतिक्रियाओं को कम करने के लिए कर रहे हैं। इसलिए, संस्कृति की आपूर्ति करता है और ऑटोलॉगस मूल के माल सबसे अच्छा पोषक तत्वों और सबसे सुरक्षित उत्पाद प्रतिनिधित्व करते हैं।

संस्कृति के माध्यम से और hMSC प्रशासन के लिए एक पाड़ के रूप में आतंच के लिए एक पूरक के रूप में अर्थात्, रोगी व्युत्पन्न सीरम - यहाँ, हम ऑटोलॉगस परिस्थितियों में अलगाव और अस्थि मज्जा hMSCs की संस्कृति के लिए एक नए प्रोटोकॉल का वर्णन है। दरअसल, hMSC / आतंच थक्का निर्माणों कई नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए अत्यंत उपयोगी हो सकता है। विशेष रूप से, हम आर्थोपेडिक सर्जरी में उनके उपयोग, जहां आतंच थक्का दाता का ही खून से निकाली गई अनुमति पर ध्यान केंद्रितप्रभावी सेल वितरण और पोषक तत्व / अपशिष्ट एक्सचेंजों। इष्टतम सुरक्षा की स्थिति को सुनिश्चित करने के लिए, यह hMSC परिवर्तन और ऊतक अतिवृद्धि के जोखिम से बचने के लिए अत्यंत महत्व का है। इन कारणों के लिए, दृष्टिकोण इस पत्र में वर्णित भी एक न्यूनतम पूर्व vivo hMSC विस्तार को इंगित करता है, आरोपण से पहले सेल वार्धक्य और शब्द के भागों में बदलाव, और अल्पकालिक आस्टियो-भेदभाव को कम osteogenic वंश विनिर्देश प्रेरित करने के लिए, इस प्रकार बाद में अनियंत्रित के जोखिम को कम करने के लिए प्रसार।

Introduction

मानव mesenchymal stromal कोशिकाओं (hMSCs) osteogenesis 1,2 बढ़ावा देने के लिए ऊतक इंजीनियरिंग में इस्तेमाल के लिए सबसे अच्छा सेल स्रोतों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे आसानी से अस्थि मज्जा और अन्य वयस्क ऊतकों से अलग, और जैसे CD90, CD105, CD73 1 के रूप में विशिष्ट सतह मार्करों व्यक्त कर रहे हैं। इसके अलावा, वे इस तरह के अस्थिकोरक, chondrocytes और adipocytes 3 के रूप में कई प्रकार की कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं। उनके चिकित्सीय प्रभाव उनके पुनर्योजी और पौष्टिकता गुण 4 के लिए जिम्मेदार हैं। hMSCs अन्य पुनर्योजी नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के रूप में, आर्थोपेडिक सर्जरी में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से। वे अधिमानतः scaffolds के साथ संयुक्त कर रहे हैं, नैदानिक परिणाम 5 में सुधार होगा।

अन्य सामग्री की तुलना में, इस तरह के आतंच जेल चिपचिपाहट, अवशोषण और पोषक तत्वों, जो यह अत्यंत ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के 6.7 की एक किस्म के लिए उपयोगी बनाने के कुशल परिवहन के रूप में दिलचस्प गुणों से पता चलता।

हमारे विधि, आतंच जेल, मरीज की अपनी ही खून से प्राप्त होता है, और ऑटोलॉगस सीरम में, इन विट्रो hMSCs संस्कृति के लिए, आर्थोपेडिक क्षेत्र 8 में संभावित चिकित्सीय समाधान के रूप में कार्यरत थे।

नैदानिक प्रयोजनों के लिए, hMSCs आमतौर पर दो मुख्य प्रक्रियाओं के माध्यम से प्रशासित रहे हैं: (i) "एक कदम" प्रक्रिया (यानी, कम से कम हेरफेर), जो अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के ऑटो की अनुमति देता है, या तो पूरा या ध्यान केंद्रित किया है (यानी, mononuclear कोशिकाओं), सर्जरी के दौरान; और (ii) "दो कदम" प्रक्रिया (यानी, व्यापक हेरफेर), जो hMSCs के पूर्व vivo विस्तार पर आधारित है आरोपण से पहले उनकी उपज बढ़ाने के लिए, और जी की आवश्यकता हैसांसद सुविधाओं 9। (- Mononuclear संस्कृतियों में 10% 1) कहा जाता है mesodermal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (MPCs), इन विट्रो भेदभाव करने में सक्षम ताजा में दिलचस्प है, गोजातीय बछड़ा सीरम के बजाय मानव वयस्क सीरम के साथ संवर्धन कोशिकाओं वसूली, कोशिकाओं के एक सबसेट की अनुमति देता है एक साथ hMSCs साथ hMSCs 10,11। इस प्रकार, hMPCs पुनर्योजी प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं जब अकेले 12,13 hMSCs साथ तुलना में। अंत में, अल्पकालिक आस्टियो-प्रेरण उनकी proliferative संभावित खोने और 12 व्यवहार्यता बिना osteogenic वंश में उनके भेदभाव शुरू करने के लिए hMSCs धक्का। इन परिणामों के पिछले अध्ययनों कि hMSCs द्वारा विवो हड्डी गठन में बढ़ाया सूचना दी है, osteogenic मध्यम 14 में एक preculture द्वारा पीछा किया पुष्टि करें। इसके अलावा, सेल डिलीवरी के लिए एक पाड़ के रूप में एक ऑटोलॉगस प्लाज्मा थक्का आसानी सर्जन से छेड़छाड़ और हड्डी गुहा 13 के आकार फिट करने के लिए ढाला जा सकता है।

गुerefore, इस विधि उन शोधकर्ताओं और चिकित्सकों जो आर्थोपेडिक अनुप्रयोगों में बिस्तर के लिए बेंच से उनकी hMSC आधारित चिकित्सा का अनुवाद करने के उद्देश्य के लिए अत्यंत उपयोगी हो सकता है।

Protocol

वर्तमान प्रोटोकॉल अनुसंधान से जुड़े मनुष्य के नैतिक आचरण के बारे में हेलसिंकी वर्ल्ड मेडिकल एसोसिएशन की घोषणा के अनुसार विकसित किया गया था। यह Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

ध्यान दें:
अस्थि मज्जा दिनचर्या कुल हिप रिप्लेसमेंट सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त किया गया था 15 (कदम करने के लिए 1.1 अनुसार); थक्का तैयारी के लिए प्लाज्मा ऑटोलॉगस परिधीय रक्त 13 से प्राप्त हुई थी; ऑटोलॉगस सीरम, संस्कृति के माध्यम के लिए एक पूरक के रूप में, एक ऑटोलॉगस पूरे रक्त apheresis से एकत्र किया गया था। सभी रोगियों की प्रक्रिया के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त की और एक लिखित सहमति पत्र पर हस्ताक्षर किए।

1. अस्थि मज्जा नमूने के संग्रह

  1. कुल हिप रिप्लेसमेंट सर्जरी (अनुसंधान अध्ययन के लिए) के बाद ऊरु दिमाग़ी नहर से अस्थि मज्जा ले लीजिए। संक्षेप में, ज को दिमाग़ी नहर की शल्य चिकित्सा की तैयारी के दौरान(- 15 एमएल, कृत्रिम अंग के आकार पर निर्भर करता है के बारे में 10) 15 कृत्रिम स्टेम OUSE, मज्जा रक्त कि overflows इकट्ठा।
    या
  2. स्थानीय संज्ञाहरण के तहत श्रोणिफलक शिखा से अस्थि मज्जा महाप्राण लीजिए, मानक hematologic के बारे में 20 प्रक्रिया का पालन - (नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए) अग्रिम में 30 घ 16।
    ध्यान दें: heparinized सीरिंज दोनों ही मामलों में (थक्का बनने से रोकने के लिए) अस्थि मज्जा वसूली के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

2. ऑटोलॉगस प्लाज्मा की तैयारी

  1. 15 मिनट के लिए 2,400 × छ पर निर्वात रक्त संग्रह K3 EDTA युक्त ट्यूबों में रोगी (3 एमएल ट्यूबों में 5.4 मिलीग्राम) और सेंट्रीफ्यूज से परिधीय रक्त के 20 एमएल लीजिए।
  2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्लाज्मा घटक Aspirate और उपयोग जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर।

3. ऑटोलॉगस सीरम की तैयारी

  1. एक कील का उपयोग कर एक हस्तांतरण बैग में प्लाज्मा की इकाई स्थानांतरण। वेल्डिंग और weig से भरा बैग डिस्कनेक्टज बैग प्लाज्मा (चित्रा 1 ए) की मात्रा की गणना करने के लिए।
  2. बंदरगाह कनेक्टर (चित्रा 1 बी) के माध्यम से w / v 10% से कम कैल्शियम gluconate इंजेक्शन लगाने के 100 मिलीग्राम / एमएल द्वारा ऑटोलॉगस प्लाज्मा जमना। बैग मिश्रण के बाद, थक्का बनने की सुविधा के लिए मिलाते हुए बिना 4 डिग्री सीओ / एन पर जगह है।
  3. आरटी पर 15 मिनट के लिए कम से 4,900 × छ बैग अपकेंद्रित्र। सेंट्रीफ्यूज से बाहर सेंट्रीफ्यूज बाल्टी ले लो और (चित्रा 1 सी) (प्लेटलेट lysate की तैयारी के लिए निर्माता के दिशा निर्देशों का पालन करें) ध्यान से बैग को हटा दें।
  4. सिर्फ दबाना ऊपर थक्का अलग निस्पंदन की सुविधा के लिए। एक कील निस्पंदन किट के आउटलेट बंदरगाह में रखा का उपयोग कर हस्तांतरण बैग को छानने का काम किट कनेक्ट करें।
  5. बैग लटका और गंभीरता से सीरम बह जाने की ब्लू दबाना खुला। फिल्टर करने के लिए दबाव लागू बैग में आतंच के हस्तांतरण से बचने के लिए नहीं है। छानने के बाद, ट्यूबिंग सील और बैग हटाने के लिए (निर्माता का पालन करेंप्लेटलेट lysate की तैयारी के लिए turer के दिशा निर्देशों)।
  6. माइक्रोबियल संक्रमण से बचने के लिए एक लामिना का प्रवाह बेंच के तहत 50 मिलीलीटर ट्यूब में अंतिम बैग और हस्तांतरण सीरम के लिए एक समर्पित लाइन कनेक्ट।
  7. फाइब्रिनोजेन के अभाव का परीक्षण और एरोबिक और anaerobic बैक्टीरियल संस्कृतियों 17 के लिए एक बाँझपन परीक्षण करने के लिए एक सिरिंज के साथ एक नमूना ले लो। उचित रूप से ट्यूबों के लेबल और उन पर फ्रीज - 20 डिग्री सेल्सियस तक उपयोग।

4. विस्तार मध्यम की तैयारी

  1. पूरा प्रसार माध्यम की 500 एमएल तैयार करें। Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम करने के लिए - कम ग्लूकोज (DMEM-एलजी), 10% ऑटोलॉगस सीरम (धारा 3 में वर्णित के रूप में प्राप्त), 2 मिमी glutamine, 1% एंटीबायोटिक समाधान और 1% कवकनाशी समाधान जोड़ें। बाँझ फिल्टर पूरा प्रसार माध्यम।

5. अस्थि मज्जा से hMSCs का अलगाव

  1. 50 एमएल शंक्वाकार Tu में सिरिंज से - (10 एमएल 5) अस्थि मज्जा नमूना हस्तांतरणहो सकता है और बाँझ खारा के साथ पतला (अनुपात 1: 4)। 50 एमएल ट्यूब भंवर 30 एस सेल समूहों disaggregate करने के लिए।
  2. उपयोग से पहले आरटी के लिए और धीरे पतला अस्थि मज्जा परत घनत्व के 15 एमएल के लिए नमूने के 20 एमएल जोड़कर घनत्व ढाल पर (दोनों परतों के मिश्रण को रोकने के लिए); घनत्व ढाल (सामग्री की तालिका देखें घनत्व 1.077 g / एल) गर्म प्रत्येक 50 एमएल ट्यूब (2A चित्रा) के लिए ढाल।
  3. पर 400 × छ 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक बिना अपकेंद्रित्र, फिर तरल-तरल इंटरफेस में mononuclear अंश को इकट्ठा करने और एक बाँझ 5 एमएल पिपेट का उपयोग कर एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
  4. एकत्र mononuclear अंश पूरा प्रसार माध्यम के साथ दो बार धोएं और सेल छर्रों प्राप्त करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 × छ ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
  5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे पूरा प्रसार माध्यम के 5 मिलीलीटर में प्रत्येक कोशिका गोली resuspend। सेल गिनती के लिए 100 अनुपात: एक 1 पर पतला।
  6. Trypan ब्लू धुंधला के साथ 1 कमजोर पड़ने सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक 1: के बाद एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।

ऑटोलॉगस सीरम की उपस्थिति में hMSCs 6. संस्कृति

  1. ताजा पूरा प्रसार माध्यम के 15 एमएल के साथ दो या दो से अधिक 75 सेमी 2 टिशू कल्चर (टीसी) बोतल भरें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए उन्हें स्थानांतरित और 5% सीओ 2 के उपयोग तक।
  2. बीज 0.3   - 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / 2 सेमी (37.5 x 10 6 कोशिकाओं ताजा पूरा प्रसार माध्यम की / 15 एमएल) और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2।
  3. इसी समय, बीज 1 एक्स 10 6 कॉलोनी बनाने के लिए यूनिट ताजा पूरा प्रसार माध्यम के 5 एमएल के साथ एक 25 सेमी 2 टीसी फ्लास्क में कोशिकाओं - तंतुकोशिका (CFU-एफ) परख। 2 सप्ताह के लिए संस्कृति (धारा 12 में जारी रखा जा सकता है)।
  4. मध्यम त्यागें और धीरे रेम को पूरा प्रसार माध्यम के साथ 6.2 कदम से बोतल धोनेnonadherent कोशिकाओं और मलबे ove। , बोतल के लिए ताजा मध्यम जोड़ें और इसके बारे में आधे से एक सप्ताह में दो बार की जगह 70 तक - 80% confluency (प्राथमिक संस्कृति, पैसेज 0 (P0)) (चित्रा 2 बी)।
  5. एक विशिष्ट पुनः संयोजक पशु मुक्त प्रोटीज का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक (सामग्री की तालिका देखें, फ्लास्क प्रति समाधान के 3 एमएल उपयोग के रूप में निर्माता से सिफारिश की) और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2। कुप्पी प्रति पूरा प्रसार माध्यम के 6 एमएल जोड़ें और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा। दोहराएँ कदम 5.6।
    नोट: महत्वपूर्ण: trypsin के बजाय इस प्रोटीज के उपयोग के कुछ mesodermal प्रोजेनिटर्स कोशिकाओं (MPCs) संस्कृति में मौजूद है, जो प्रतिरोधी trypsin है की वसूली की अनुमति देता है।
  6. 3,000 कोशिकाओं नए 75 सेमी 2 टीसी बोतल (P1) में / 2 सेमी (चित्रा -2) - आगे विस्तार के लिए 2,000 पर सेल निलंबन replate।
  7. MSCs के भेदभाव क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए कोशिकाओं की aliquots का प्रयोग करेंosteogenic, adipogenic और chondrogenic प्रजातियों की ओर। निर्माता की सिफारिशों (चित्रा 2 डी) निम्नलिखित भेदभाव assays के प्रदर्शन।
    नोट: विभिन्न तरीकों धुंधला multilineage भेदभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

7. दवा की खुराक के साथ एक osteogenic मीडियम की तैयारी

  1. एस्कॉर्बिक एसिड समाधान (पतला समाधान 1A:। एस्कॉर्बिक एसिड 200 मिलीग्राम / एमएल (सामग्री की तालिका) 01:10 एक 20 मिलीग्राम / एमएल समाधान (समाधान 1 बी प्राप्त करने के लिए, काम समाधान देखें DMEM-एलजी के साथ,) समाधान 1 ए का स्टॉक aliquots और -20 डिग्री सेल्सियस तक उपयोग में 1 बी।
  2. Resuspend बाँझ पानी के 10 एमएल में 1 ग्राम hydrocortisone (समाधान 2A: hydrocortisone 100 मिलीग्राम / एमएल (सामग्री की तालिका देखें) 1 पर पतला समाधान 2A:। 1,000 DMEM-एलजी के साथ एक 100 माइक्रोग्राम / एमएल समाधान (समाधान 2 बी प्राप्त करने के लिए, काम समाधान)। समाधान 2A और -20 डिग्री सेल्सियस तक उपयोग में 2 बी के शेयर aliquots।
  3. उपयोग करने पर पीताजा osteogenic मध्यम प्रकार के रूप में repare: 10% ऑटोलॉगस सीरम, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड और 0.4 माइक्रोग्राम / एमएल hydrocortisone साथ DMEM-एलजी जोड़ें। बाँझ फिल्टर osteogenic माध्यम।

8. osteogenic पूर्व प्रेरण और hMSCs की वसूली

  1. पूरी तरह से प्रसार मध्यम हटाने और सेल कटाई से पहले osteogenic मध्यम 96 घंटे जोड़ने (यानी, 80 - 90% संगम आमतौर पर 7 डी में पहुँच जाता है)। एक अतिरिक्त osteogenic मध्यम परिवर्तन सेल कटाई से पहले 24 घंटे प्रदान करें।
  2. कदम 6.5 में वर्णित है और धीरे गोली एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पूरा प्रसार के माध्यम से 2 एमएल जोड़ने resuspend के रूप में कोशिकाओं को अलग करें।
    नोट: सेल व्यवहार्यता osteoinduction का एक परिणाम के रूप में (लगभग 10%) कम किया जा सकता है। सेलुलर समुच्चय मनाया जा सकता है।
  3. मतगणना के बाद, 5 मिनट के लिए 300 × छ पर पूरा प्रसार मध्यम और सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें। 2 एक्स 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं / 2 - 1 से धीरे गोली Resuspendऑटोलॉगस प्लाज्मा के एमएल प्रति 50 एमएल ट्यूब (धारा 2 देखें)।

9. hMSC / आतंच थक्का निर्माणों के तैयारी

  1. कदम 8.3 से प्राप्त प्रत्येक 50 एमएल ट्यूब 100 मिलीग्राम / एमएल में कैल्शियम gluconate के 150 μl जोड़ें। और कोमल झटकों के तहत कोशिकाओं resuspend।
  2. HMSC / आतंच थक्का निर्माणों (चित्रा 3 ए) प्राप्त करने के लिए 30 मिनट - 15 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं और 5% सीओ 2। कोशिकाओं के बिना एक आतंच थक्का निर्माण तैयार एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।
    नोट: महत्वपूर्ण: यह, सेल व्यवहार्यता परख पहले कम से कम 2 घंटे इस पर नियंत्रण का थक्का तैयार करने के लिए recommendable है के रूप में यह crosslink करने के लिए 30 मिनट या अधिक लेता है।

10 सेल व्यवहार्यता परख

  1. निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार, 50 एमएल ट्यूब से तरल निकालें और 10% वी / वी सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक युक्त पूरा प्रसार माध्यम के 1 एमएल जोड़ने (सामग्री की तालिका देखें एबी)।
  2. सेते वें37 डिग्री सेल्सियस पर ई ट्यूब और 5% 3 घंटे के लिए सीओ 2। (; T0 समय 0 पर एबी) 600 एनएम के संदर्भ तरंग दैर्ध्य के साथ 570 एनएम पर absorbance के उपाय।
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा पूरा प्रसार के माध्यम से 2 एमएल जोड़ने। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 5% सीओ 2 हे / एन। अगले दिन (एबी समय 24 घंटे में; T24), दोहराने 10.1 10.3 (चित्रा 3 बी) कदम।

सेल व्यवहार्यता और आतंच थक्का Constructs अंदर कैल्शियम के जमाव के 11. histologic मूल्यांकन

  1. डब्ल्यू / वी तटस्थ बफर formalin हे / 4 डिग्री सेल्सियस एन में 4% में hMSC / आतंच थक्का निर्माणों को ठीक करें। 15 मिनट और 70% इथेनॉल में दुकान के लिए डी-पीबीएस में धो 4x।
  2. 45 मिनट के लिए दो बार 30 मिनट, 95% के लिए 80% एक बार और 1 घंटे के लिए 100% 3x: नमूने 40 डिग्री सेल्सियस पर वर्गीकृत इथेनॉल की एक श्रृंखला में निर्जलीकरण। 40 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए xylene में दो बार स्पष्ट करें।
  3. 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर तरल पैराफिन में नमूने कुल्ला और उन्हें एम्बेड। एक microtome साथ पैराफिन ब्लॉक में कटौती और माउंट टीवह वर्गों (5 माइक्रोन) गिलास स्लाइड पर।
  4. मानक hematoxylin और eosin (एच एंड ई) विधि (चित्रा -3 सी) का उपयोग deparaffinized वर्गों दाग।
  5. 15 मिनट, 2 मिनट के लिए 0.5% Pyrogallol, और 2 मिनट के लिए 5% सोडियम thiosulfate के लिए 1% चांदी नाइट्रेट के साथ वर्गों के इलाज से वॉन Kossa धुंधला प्रदर्शन करना। साथ 0.1% परमाणु फास्ट लाल एक समाधान 5 मिनट के लिए 5 ग्राम एल्यूमीनियम सल्फेट युक्त पतला वर्गों Counterstain और 5 मिनट के लिए पानी के नल में उन्हें कुल्ला। एक बढ़ते एजेंट के साथ वर्गों माउंट।
  6. प्रकाश माइक्रोस्कोप (400X बढ़ाई) (चित्रा 3 डी) के तहत काले कणिकाओं के रूप में खनिज बयान का मूल्यांकन।

12. CFU एफ परख

  1. डी-पीबीएस के साथ (कदम 6.3 से।) 25 सेमी 2 फ्लास्क धो लें। मानक मई-Grunwald / Giemsa विधि का उपयोग कर दाग। नेत्रहीन एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अलग-अलग कालोनियों (चित्रा 4) रन बनाकर hMSC संख्या यों।
    नोट: यदिअस्थि मज्जा 1.2 चरण में के रूप में लिया जाता है। और वर्गों 2 - 9 आवश्यक नियामक मंजूरी के साथ अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) में प्रदर्शन कर रहे हैं, hMSC / आतंच थक्का निर्माणों आर्थोपेडिक अनुप्रयोगों के लिए प्रत्यारोपित किया जा सकता है।

Representative Results

ऑटोलॉगस सीरम की तैयारी

प्लाज्मा जमावट, स्थानांतरण बैग के लिए कैल्शियम gluconate जोड़कर प्रदर्शन किया, के रूप में hMSC संस्कृति के लिए आवश्यक है, बड़ी मात्रा में ऑटोलॉगस सीरम की वसूली की अनुमति देता है। दरअसल, इस तकनीक के साथ, यह संभव है (चित्रा 1) सीरम के 200 मिलीलीटर को प्राप्त करने के लिए है।

HMSC अलगाव, संस्कृति और भेदभाव ऑटोलॉगस सीरम का उपयोग कर

अस्थि मज्जा कोशिकाओं mononuclear एक घनत्व ढाल, जो एक मध्यवर्ती परत अंगूठी (2A चित्रा) को जन्म देता है का उपयोग कर अलग कर रहे हैं। इन कोशिकाओं चढ़ाना और कपड़े धोने के साथ nonadherent लोगों को दूर करके, यह hMSCs (चित्रा 2 बी) को अलग करने के लिए संभव है। ऑटोलॉगस संस्कृति शर्तों के तहत, कोशिकाओं के एक सबसेट, MPCs कहा जाता है, P0 पर और टी प्रतिशत में पता चला रहे हैंओ 10%, रोगी परिवर्तनशीलता (चित्रा 2 बी) पर निर्भर करता है। MPCs अभी भी replating (यानी, P1) यदि प्रोटीज सेल passaging (चित्रा 2 सी) के लिए प्रयोग किया जाता है के बाद से मौजूद हैं। hMSCs पृथक और एक ऑटोलॉगस सेटिंग में सुसंस्कृत तीन प्रसिद्ध mesodermal प्रजातियों (osteogenic, adipogenic, और chondrogenic) की ओर अंतर करने के लिए उनकी क्षमता को बनाए रखने। भेदभाव assays मानक (nonautologous) संस्कृति की स्थिति का उपयोग कर प्राप्त उन लोगों के साथ hMSC आबादी पहचान तुलना करने के लिए प्रदर्शन किया गया। जैसा कि इस प्रोटोकॉल, वॉन Kossa धुंधला हो जाना, आज़मियम tetroxide धुंधला हो जाना, और Alcian ब्लू धुंधला पीएच 1 पर कार्यक्षमता के लिए assays भेदभाव मीडिया निर्माता द्वारा सुझाए गए उन के स्थान पर चुना गया था (चित्रा 2 डी) (सामग्री की तालिका देखें)।

तैयार करना, व्यवहार्यता और एमएससी / आतंच थक्का निर्माणों की histologic लक्षण वर्णन

(चित्रा 3 ए) से घिरा हुआ एक जेली डिस्क के गठन के लिए अग्रणी में बिखरे हैं। इन प्लाज्मा के थक्के के अंदर, hMSCs के रूप में रंग (कोशिकाओं के बिना नियंत्रण) नीले रंग से सेल व्यवहार्यता डाई T24 के परिवर्तन द्वारा प्रदर्शन गुलाबी (cellularized थक्का) (चित्रा 3 बी), व्यवहार्य हैं। थक्का के अंदर सेल व्यवहार्यता एच ई धुंधला द्वारा की पुष्टि की है, एक अच्छी तरह से संरक्षित सेल आकारिकी (चित्रा 3 सी) दिखा। इसके अलावा, सिर्फ दूसरा सेल फसल से पहले कम से कम एक osteoinduction प्रेरित hMSCs (चित्रा 3 डी) द्वारा प्रारंभिक कैल्शियम के जमाव को जन्म देता है।

कॉलोनी बनाने की इकाई

संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद hMSC कालोनियों की उपस्थिति CFU एफ परख (चित्रा 4) से दिखाया गया है।

एस = "jove_step" fo: रख-together.within-पेज = "1"> एमएससी / आतंच थक्का के आवेदन हड्डी गैर संघ में निर्माण

इस विधि (1.1 कदम) में वर्णित के रूप में प्राप्त HMSC / आतंच थक्का निर्माणों को सफलतापूर्वक 8 अनुकंपा मामलों 13 में गंभीर ऊपरी अंग nonunions इलाज के लिए लागू किया गया। लंबी अवधि (अधिकतम 7.6 महीने) मूल्यांकन के सभी रोगियों के लिए सफल नैदानिक ​​और कार्यात्मक परिणामों की पुष्टि की, ऊतक अतिवृद्धि या ट्यूमर गठन के सबूत के बिना।

आकृति 1
चित्रा 1. ऑटोलॉगस सीरम की तैयारी।
(ए) प्लाज्मा इकाई कील का उपयोग कर एक हस्तांतरण बैग में स्थानांतरित कर रहा है; (बी) प्लाज्मा बंदरगाह कनेक्टर के माध्यम से कैल्शियम gluconate इंजेक्शन द्वारा जमा हुआ है; (सी) एक रक्त बैग सेंट्रीफ्यूज सीरम अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है।/files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. hMSC अलगाव, संस्कृति और भेदभाव ऑटोलॉगस सीरम का उपयोग कर।
(ए) mononuclear सेल परत (ब्लू लाइन विंडो में) अस्थि मज्जा एक घनत्व ढाल के साथ centrifuging के बाद प्राप्त; (बी) सेल संस्कृति यह P1 पर प्रकट होता है के रूप में; (सी) सेल संस्कृति के रूप में यह P0 (प्राथमिक संस्कृति) में प्रकट होता है; (बी - सी) तीर एमएससी संस्कृति में MPCs की उपस्थिति दिखाने के लिए। स्केल बार 100 माइक्रोन है; (डी) multilineage भेदभाव assays के Histochemical का परिणाम है। Osteogenic भेदभाव काले, adipogenic भेदभाव में खनिज मैट्रिक्स बयान के लिए वॉन Kossa धुंधला का उपयोग कर मूल्यांकन किया है फैटी रिक्तिकाएं की उपस्थिति से दिखाया गया है, आज़मियम tetroxi से काले रंग में दागडे, और chondrogenic भेदभाव सल्फेटकृत ग्लाइकोसअमिनोग्लाइकन्स, जो पीएच 1. स्केल पट्टी पर Alcian ब्लू धुंधला द्वारा सियान में दाग रहे हैं की मौजूदगी से प्रदर्शित किया जाता है 50 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. तैयार करना, व्यवहार्यता और histologic एमएससी / आतंच थक्का निर्माणों के विशेषता।
(ए) hMSC / आतंच थक्का के रूप में यह पार से जोड़ने के बाद दिखाई देता निर्माण; (बी) अटल बिहारी परख के परिणाम: के रूप में, (कोशिकाओं के बिना नियंत्रण, सही पर) नीले रंग से सेल व्यवहार्यता डाई (T24) के बदले रंग के द्वारा प्रदर्शन किया MSCs, आतंच थक्का अंदर व्यवहार्य हैं गुलाबी (cellularized थक्का, पर बाएं)। (सी - डी) hMSC / आतंच थक्का निर्माणों की Histochemical का परिणाम है। स्केल पट्टी है50 माइक्रोन। (सी) Hematoxylin और आतंच मैट्रिक्स में एम्बेडेड व्यवहार्य कोशिकाओं दिखा Eosin धुंधला; (डी) खनिज मैट्रिक्स बयान वॉन Kossa धुंधला है, जो एक प्रारंभिक osteogenesis की पुष्टि से काले रंग में दाग। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. CFU एफ परख।
एक कुप्पी मई-Grunwald / Giemsa विधि से सना हुआ hMSCs साथ सुसंस्कृत का चित्र। में बढ़कर क्षेत्र एक प्रकाश माइक्रोग्राफ एक hMSC कॉलोनी की आकृति विज्ञान दिखा रहा है। स्केल बार 100 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 5. hMSC / आतंच थक्का के आवेदन अस्थि Nonunion में निर्माण।
(ए) एक मरीज Pseudarthrosis से प्रभावित के ऊपरी अंग की एक्स-रे; (बी) सिर्फ आरोपण से पहले hMSC / आतंच थक्का निर्माण; (सी) hMSC / आतंच थक्का निर्माण के सर्जिकल आवेदन; (डी) एक ही मरीज की ऊपरी अंग के 5 साल के बाद एक्स-रे। यह आंकड़ा Giannotti एस एट अल से पुनर्प्रकाशित है। कम से कम 13 संशोधनों के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस प्रोटोकॉल चिंता का महत्वपूर्ण कदम मानव वयस्क सीरम और प्रोटीज के उपयोग, जो एक BIOSAFE hMSC चिकित्सा प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं। विशेष रूप से, मानव वयस्क सीरम जबकि प्रोटीज, फसल सुनिश्चित करता है MPCs की, अलगाव और रखरखाव के लिए सक्षम बनाता है। ये अपरिपक्व अस्थि मज्जा कि ताजा hMSCs को जन्म दे सकते हैं इस प्रकार संस्कृति समय के साथ व्यवहार्य hMSCs के एक जलाशय को सुनिश्चित करने में मौजूद कोशिकाओं रहे हैं। नहीं सभी MPCs एकत्र किया जा सकता है, क्योंकि प्रोटीज गतिविधि के लिए बढ़ती जोखिम समय hMSC व्यवहार्यता के लिए हानिकारक है। इस कारण से, एक 10 मिनट प्रोटीज ऊष्मायन MPCs की वसूली और hMSCs की व्यवहार्यता के बीच इष्टतम समझौते के रूप में चयनित किया गया था। एक और महत्वपूर्ण कदम osteodifferentiation समय है। दरअसल, इन विट्रो osteodifferentiation में एक व्यापक काफी सेल व्यवहार्यता को कम करेगा, इस प्रकार इन विवो में अंतिम हड्डी गठन को प्रभावित। पिछले एक महत्वपूर्ण कदम ऑटोलॉगस bioresorbable पाड़ का लाभ उठाने में होते हैं, जोज प्लाज्मा के थक्के से एक आतंच जेल में कोशिकाओं (hMSCs और MPCs) embedding द्वारा प्राप्त की है।

MPCs की उपज बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम उच्च एकाग्रता में mononuclear कोशिकाओं बीज के लिए है। apheresis प्रक्रियाओं का उपयोग प्लाज्मा प्राप्त करने के लिए और कैल्शियम gluconate के साथ इलाज के लिए यह संभव बड़ी मात्रा में ऑटोलॉगस सीरम प्राप्त करने के लिए बनाता है। यह देखा गया है कि एक माध्यम के पूरक के रूप में मानव सीरम hMSC संस्कृतियों में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के बराबर है। हालांकि, हमारे अनुभव में, एक पूरा मध्यम FBS के साथ पूरक मानव वयस्क सीरम की तुलना में तेजी वार्धक्य के लिए योगदान देता है। एक महत्वपूर्ण कदम है कि hMSCs करने के लिए एक न्यूनतम osteoinduction प्रशासन की है। दरअसल, इस उपचार, आसानी से osteogenic वंश की दिशा में अंतर करने के लिए कोशिकाओं को ले जाता है इस प्रकार विवो में आगे सेल परिवर्तन से बचने के लिए उपयोगी जा रहा है। न्यूनतम osteoinduced hMSCs का एक अच्छा व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, यह ध्यान सिफारिशों कदम 6.5 में वर्णित का पालन करने की सिफारिश की है। एकडी 8.2।, हैंडलिंग, centrifuging और मध्यम मात्रा सहित जोड़ा जाएगा। एक apheresis प्रक्रिया उपलब्ध नहीं है, तो यह अभी भी जमा एबी सीरा की खरीद के द्वारा विकल्प में रोगी को खींचता है या, कई रक्त प्रदर्शन, द्वारा इस प्रोटोकॉल के लिए बाहर ले जाने के लिए संभव है। जाहिर है, आदेश में बेंच-टु-बिस्तर से इस प्रोटोकॉल में लाने के लिए, यह अनिवार्य जीएमपी सेल कारखानों, या समकक्ष है, उपलब्ध है।

इस तकनीक को चिंता का विषय है खून की कमी, hematological-ऑन्कोलॉजी और आर्थोपेडिक रोगियों अस्थिमज्जा का प्रदाह से प्रभावित के आवेदन करने के लिए सीमाओं।, खून की कमी रोगियों से रक्त की बड़ी मात्रा में ड्राइंग, परहेज किया जाना चाहिए। Oncologic रोगियों में, सेल के नमूनों की गुणवत्ता, रसायन चिकित्सा उपचार से प्रभावित है, जबकि अस्थिमज्जा का प्रदाह रोगियों में संक्रमण अंतिम परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। सभी मामलों में ऑटोलॉगस सीरम अपर्याप्त या अनुपयुक्त है, जमा पुरुष एबी सीरा एक अच्छा विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं।

सेल / आतंच clo का प्रयोगसंभव नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए टी निर्माणों एक पूरी तरह से ऑटोलॉगस सेल थेरेपी, जो सर्जरी के दौरान संभाल और मोल्ड करने के लिए आसान हो सकता है, उत्कृष्ट परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप हड्डी गैर यूनियनों 13 के इलाज के लिए जारी करने के लिए महत्वपूर्ण है। न्यूनतम हेरफेर और व्यापक हेरफेर 9: नैदानिक प्रयोजनों के लिए, hMSCs आमतौर पर दो मुख्य प्रक्रियाओं के माध्यम से प्रशासित रहे हैं। इस तरह के सेल आकृति विज्ञान और आकार 18 में असामान्यताएं रूप में एक व्यापक पूर्व vivo संस्कृति से संबंधित समस्याओं को दूर करने के लिए, हम एक कम समय पूर्व vivo सेल विस्तार और आस्टियो-भेदभाव (केवल 4 घ) का प्रदर्शन किया।

इसकी क्षमता और लंबे Xeno मुक्त प्रोटोकॉल लघु सेल विस्तार और osteodifferentiation समय के साथ, इस पत्र में वर्णित एक साथ, प्रदर्शन आदेश विवो में तेजी से हड्डी उत्पादन प्राप्त करने के लिए क्लीनिक में प्रासंगिक हो, ऊतक अतिवृद्धि और परिवर्तन के सबूत के बिना, इस प्रकार की पुष्टि हड्डी की मरम्मत में अवधि के सुरक्षा (चित्रा 5) 13।

इस रिपोर्ट में प्रस्तुत कार्यप्रणाली आर्थोपेडिक सर्जरी में संभव उपयोग के लिए ऑटोलॉगस की स्थिति में इन विट्रो विस्तार में प्रभावकारिता और hMSC की सुरक्षा का प्रदर्शन करने के उद्देश्य से किया जाता है। इस प्रोटोकॉल एक मध्यम ऑटोलॉगस सीरम के साथ पूरक और ऑटोलॉगस आतंच थक्का में एम्बेडेड है, इस प्रकार एक पूरी तरह से ऑटोलॉगस सेल थेरेपी को सुनिश्चित करने में अस्थि मज्जा और सुसंस्कृत से अलग hMSCs कार्यरत हैं। दो गुना osteogenic प्रेरण, सिर्फ दूसरी टुकड़ी से पहले, अस्थिकोरक में अंतर करने hMSC क्षमता में सुधार। नतीजतन, इस तकनीक अस्थि दोष में अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है, क्योंकि यह Pseudarthrosis तक सीमित नहीं है। संभव है भविष्य अनुप्रयोगों ढलान पुटी और हड्डी हानि प्रबंधन को शामिल कर सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triple Select (1x) GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES 12563-029 cell culture
Trypan blue stain  GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES 15250061 cell culture
DMEM-LG, no glutamine, no phenol red GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES 11880-028  cell culture
Glutamax (100x) Gibco, Life Technologies 35050038 cell culture
Penicillin/Streptomycin sol. Gibco, Life Technologies 15140122 cell culture
Alamar Blue (AB) Gibco, Life Technologies DAL1025 proliferation/viability assay
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-14440-02 cell culture
D-PBS Gibco, Life Technologies 14190-094 cell culture
StemMACS AdipoDiff Media Miltenyi Biotech 130-091-677 cell culture
StemMACS ChondroDiff Media Miltenyi Biotech 130-091-679 cell culture
hMSC Osteogenicdiff BulletKit Euroclone  LOPT3002 cell culture
Vitamin C (ascorbic acid) Bayer ATC Code: A11GA01 Pharmaceutical grade drug
Flebocortid Richter (hydrocortisone) Aventis Pharma ATC Code: H02AB09 Pharmaceutical grade drug
Victor X3, reader PerkinElmer 2030 multilabel reader proliferation/viability assay
Silver nitrate Sigma Aldrich 209139 histological assay
Pyrogallol Sigma Aldrich 16040 histological assay
Sodium Thiosulphate Sigma Aldrich S8503 histological assay
Histoplast LP Thermo Scientific 8332 histological assay
Methanol Sigma Aldrich 32213 histological assay
Ethanol Sigma Aldrich 2860 histological assay
Nuclear fast red Sigma Aldrich 60700 histological assay
Formalin Bio-optica 05-K01009-X40 histological assay
Eosin B Sigma Aldrich 45260 histological assay
DPX Sigma Aldrich 6522 histological assay
Haematoxylin Sigma Aldrich H3136 histological assay
Aluminium Sulphate Sigma Aldrich 202614 histological assay
Xylol Sigma Aldrich 534056 histological assay
Microtome Leika histological assay
May Grunwald Sigma Aldrich MG1L-1L histological assay
Giemsa Sigma Aldrich 32884-250ML histological assay
Transfer bag Biomérieux BC0300031 cell culture
Filtration kit Macopharma BC0800010 cell culture
Calcium Gluconate Galenica Senese Pharmaceutical grade drug
Bact Alert Biomérieux 259790 anaerobic  microbiological assay
Bact Alert Biomérieux 259789 aerobic  microbiological assay
Steryle Luer-Lok Syringe 50 mL BD Plastipak 300865 cell processing
Heraeus Cryofuge 6000i Thermo Scientific blood bag centrifuging
SL16R Centrifuge Thermo Scientific blood tube centrifuging

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 118 मानव mesenchymal stromal बेचता है ऑटोलॉगस आतंच mesodermal पूर्वज कोशिकाओं osteogenic भेदभाव ऊतक इंजीनियरिंग
Mesenchymal stromal सेल संस्कृति और ऑटोलॉगस शर्तों में डिलिवरी: आर्थोपेडिक अनुप्रयोगों के लिए एक स्मार्ट दृष्टिकोण
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Trombi, L., Danti, S., Savelli, S., Moscato, S., D'Alessandro, D., Ricci, C., Giannotti, S., Petrini, M. Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications. J. Vis. Exp. (118), e54845, doi:10.3791/54845 (2016).

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