Dyrkning humane mesenchymale stromacellers (hMSC'er) med autologt serum, reducerer risikoen for afstødning af xenogene materiale, og andre negative virkninger. Det giver også mulighed for genopretning af en delmængde af mesodermale stamfædre, som kan levere friske hMSC'er. Integrering hMSC'er i en autolog fibrinkoagel muliggør nem håndtering og effektiv kirurgisk implantation.
Humane mesenchymale stromacellers (hMSC'er) dyrkes in vitro med forskellige medier. Grænser for deres anvendelse i kliniske omgivelser, dog primært afhænge af potentielle biohazard og betændelse risici udøves af xenogene næringsstoffer til deres kultur. Menneskelige derivater eller rekombinante materialer er de første valg kandidater til at reducere disse reaktioner. Derfor kultur kosttilskud og materialer af autolog oprindelse repræsenterer de bedste næringsstoffer og de sikreste produkter.
Her beskriver vi en ny protokol til isolering og dyrkning af knoglemarv hMSC'er i autologe forhold – nemlig patient-afledt serum som supplement til dyrkningsmediet og fibrin som et stillads for hMSC administration. Faktisk kunne hMSC / fibrinkoagel konstruktionerne være særdeles nyttige til adskillige kliniske anvendelser. Især fokuserer vi på deres anvendelse i ortopædisk kirurgi, hvor fibrinkoagel afledt af donorens eget blod tilladtudvekslinger effektiv levering celle og næringsstoffer / affald. For at sikre optimale sikkerhedsforhold, er det af yderste vigtighed at undgå risikoen for hMSC transformation og væv tilgroning. Af disse grunde den fremgangsmåde, der er beskrevet i dette dokument, viser også en minimalt ex vivo hMSC ekspansion, for at reducere celleældning og morfologiske ændringer, og kortfristet osteo-differentiering før implantering, at inducere osteogene afstamning specifikation, således formindsker risikoen for efterfølgende ukontrolleret proliferation.
Humane mesenchymale stromacellers (hMSC'er) er en af de bedste cellekilder til anvendelse i vævskonstruktion til aktivering af osteogenese 1,2. De er let isoleret fra knoglemarv og andre voksne væv og hurtig typiske overflademarkører såsom CD90, CD105, CD73 en. Desuden kan de differentiere til flere celletyper, såsom osteoblaster, chondrocytter og adipocytter 3. Deres terapeutiske virkninger tilskrives deres regenerative og trofiske egenskaber 4. hMSC'er kan anvendes i ortopædisk kirurgi, såvel som i andre regenerative kliniske anvendelser. De kombineres fortrinsvis med stilladser, for at forbedre det kliniske resultat 5.
Sammenlignet med andre materialer, fibringelen viser interessante egenskaber, såsom klæbeevne, resorption og effektiv transport af næringsstoffer, hvilket gør det ekstremt anvendelige til en række af vævsdyrkningsapplikationer 6,7.
<p class = "jove_content"> Den største udfordring i at oversætte en tissue engineering tilgang til kliniske anvendelser er at opnå et fuldt biokompatible og BIOSAFE stillads og en xeno-dyrkningsmedium, der undgår enhver infektiøse eller reaktiv effekt.I vores fremgangsmåde, fibrin gel, der er afledt fra patientens eget blod, og autologt serum, til in vitro hMSC'er kultur blev anvendt som en mulig terapeutisk løsning på det ortopædiske felt 8.
Til kliniske formål, er hMSC'er sædvanligvis administreres via to vigtigste procedurer: (i) "one-step" procedure (dvs. minimal manipulation), der tillader den automatiske transplantation af knoglemarv, enten helt eller koncentreret (dvs. mononukleære celler), under kirurgi; og (ii) "to-trins" procedure (dvs. omfattende manipulation), som er baseret på ex vivo ekspansion af hMSC'er øge udbyttet før implantation, og kræver GMP faciliteter 9. Interessant, dyrkning af celler med human voksen serum i stedet for bovin kalveserum tillader genvinding, sammen med hMSC'er, af en delmængde af celler (1 – 10% i mononukleære kulturer) kaldet mesodermal progenitorceller (MPCS), i stand til in vitro differentiering til frisk hMSC'er 10,11. Således kan hMPCs spille en betydelig rolle i den regenerative proces sammenlignet med hMSC'er alene 12,13. Endelig kortsigtet osteo-induktion skubber hMSC'er til at starte deres differentiering i den osteogene afstamning uden at miste deres proliferative potentiale og levedygtighed 12. Disse resultater bekræfter tidligere undersøgelser, der har rapporteret forøget in vivo knogledannelse ved hMSC'er, efterfulgt af en forkultur i osteogen medium 14. Desuden kan en autolog plasmaclot som et stillads for celle levering nemt manipuleres af kirurgen og formet til at passe formen af knoglen hulrum 13.
therefore, kan denne metode være yderst nyttig for de forskere og klinikere, der sigter mod at omsætte deres hMSC-baseret behandling fra bænken til bedside i ortopædiske applikationer.
De kritiske trin i denne protokol vedrører brugen af voksent menneske serum og protease, som gør det muligt at opnå en BIOSAFE hMSC terapi. Især voksent menneske serum muliggør isolation og vedligeholdelse, mens protease sikrer høsten, af Middelhavspartnerlandene. Disse er umodne celler til stede i knoglemarven, der kan give anledning til nye hMSC'er, hvilket sikrer et reservoir af levedygtige hMSC'er langs dyrkningstid. Ikke alle Middelhavspartnerlandene kan opsamles, da øge eksponeringen tid til protease aktivitet er til skade for hMSC levedygtighed. Af denne grund blev en 10 min protease inkubation valgt som optimal kompromis mellem genopretning af Middelhavspartnerlandene og levedygtigheden af hMSC'er. Et andet afgørende skridt er osteodifferentiation tid. Faktisk ville en omfattende in vitro osteodifferentiation betydeligt reducere cellernes levedygtighed, hvilket påvirker den endelige knogledannelse in vivo. Det sidste kritiske trin består i benytter af en autolog bioresorberbart stillads, which opnås ved indlejring af cellerne (hMSC'er og MPCS) i en fibringel fra plasma koagulation.
Et vigtigt skridt til at forøge udbyttet af Middelhavspartnerlandene er at frø mononukleære celler ved højere koncentration. Under anvendelse afereseprocedurer at opnå plasma og behandle det med calciumgluconat gør det muligt at opnå autologt serum i store mængder. Det er blevet observeret, at humant serum som medium supplement er sammenlignelig med føtalt bovint serum (FBS) i hMSC-kulturer. Men vores erfaring, et komplet medium suppleret med FBS bidrager til hurtigere ældning end voksne mennesker serum,. Et vigtigt skridt er at administrere en minimal osteoinduktion til hMSC'er. Faktisk har denne behandling fører cellerne til nemt differentiere mod osteogene afstamning, således er nyttigt at undgå yderligere celletransformation in vivo. For at opretholde en god levedygtighed minimalt osteoinduced hMSC'er, anbefales det at følge nøje anbefalingerne beskrevet i trin 6.5. end 8.2., herunder håndtering, centrifugering og mellemstore beløb, der skal tilføjes. Hvis en aferese procedure ikke er tilgængelig, er det stadig muligt at udføre denne protokol ved at udføre flere blod trækker til patienten eller, alternativt, ved at købe samlet AB sera. , For at bringe denne protokol fra bænken-til-seng, er naturligvis det obligatorisk at have GMP cellefabrikker, eller ækvivalenter, til rådighed.
Begrænsninger for anvendelsen af denne teknik vedrører anæmiske, hæmatologiske-onkologi og ortopædiske patienter ramt af osteomyelitis., Tegning store mængder blod fra anæmiske patienter, bør undgås. I onkologiske patienter, er kvaliteten af celleprøver påvirket af kemoterapi behandlinger, mens infektion hos osteomyelitis patienter kan påvirke det endelige resultat. I alle de tilfælde, hvor den autologe serum er utilstrækkelig eller uegnet, samlet mandlige AB sera repræsenterer et godt alternativ.
Brug af celle / fibrin clot konstruktioner til mulige kliniske anvendelser er afgørende at frigive en helt autolog celleterapi, som kunne være let at håndtere og skimmel under kirurgi, hvilket resulterer i fremragende resultater til behandling af knogle manglende opheling 13. For kliniske formål, er hMSC'er normalt administreres via to procedurer: minimal manipulation og omfattende manipulation 9. For at overvinde problemerne i forbindelse med en omfattende ex vivo kultur, såsom abnormiteter i cellemorfologi og størrelse 18, udførte vi en kort tid ex vivo celle ekspansion og osteo-differentiering (kun 4 d).
Det xeno-fri protokollen beskrevet i dette papir, sammen med de korte celle ekspansion og osteodifferentiation gange, vist sig at være relevant i klinikker for at opnå hurtig knogle produktion in vivo, uden tegn på væv overvækst og transformation, hvilket bekræfter dets effektivitet og lang -term sikkerhed i knoglereparation (figur 5) </strong> 13.
Metoden præsenteres i denne rapport til formål at dokumentere effekten og sikkerheden af hMSC in vitro ekspansion i autologe betingelser for eventuel anvendelse i ortopædisk kirurgi. Denne protokol beskæftiger hMSC'er isoleret fra knoglemarv og dyrkes i et medium suppleret med autologt serum og indlejret i autolog fibrinkoagel, hvilket sikrer en fuldstændig autolog celleterapi. Det dobbelte osteogen induktion, lige før den anden løsrives, forbedrer hMSC evne til at differentiere til osteoblaster. Som følge heraf er denne teknik er særlig egnet til anvendelser i knogledefekter, eftersom den ikke er begrænset til Pseudartrose. Mulige fremtidige applikationer kan indebære talus cyste og knogletab management.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.
Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
DMEM-LG, no glut, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
Glutamax (100X) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
Penicillin Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
Microtome | Leika | histological assay | |
May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |