Odling humana mesenkymala stromaceller celler (hMSCs) med autologt serum, minskar risken för avstötning av xenogena material och andra negativa effekter. Det gör det också möjligt för återvinning av en delmängd av mesodermala stamceller, som kan leverera färska hMSCs. Bädda hMSCs i en autolog fibrinkoagel möjliggör enkel hantering och effektiv kirurgisk implantation.
Humana mesenkymala stromaceller celler (hMSCs) odlas in vitro med olika medier. Gränser för deras användning i kliniska situationer, dock främst bero på potentiella Biohazard och inflammation risker som utövas av xenogena näringsämnen för sin kultur. Mänskliga derivat eller rekombinanta material är förstahandsvalet kandidater för att minska dessa reaktioner. Därför, kultur kosttillskott och material autolog ursprung representerar de bästa näringsämnen och de säkraste produkterna.
Här beskriver vi ett nytt protokoll för isolering och odling av benmärgs hMSCs i autologa förhållanden – det vill säga, patient härlett serum som ett komplement för odlingsmedium och fibrin som en byggnadsställning för hMSC administration. I själva verket kunde hMSC / fibrinkoagel konstruktionerna vara ytterst användbart för flera kliniska tillämpningar. Framför allt fokuserar vi på deras användning i ortopedisk kirurgi, där fibrintromben härrör från givarens eget blod tillåtseffektiv cell leverans och närings / avfalls utbyten. För att säkerställa optimala säkerhetsförhållanden, är det av yttersta vikt för att undvika risken för hMSC omvandling och vävnads överväxt. Av dessa skäl, det tillvägagångssätt som beskrivs i detta dokument visar också en minimalt ex vivo hMSC expansion, för att minska cellåldrande och morfologiska förändringar, och på kort sikt osteo-differentiering före implantation, för att inducera osteogen härstamning specifikation, vilket minskar risken för okontrollerad spridning.
Humana mesenkymala stromaceller celler (hMSCs) representerar en av de bästa cellkällor för användning i vävnadsteknik för främjande av osteogenes 1,2. De är lätt isoleras från benmärg och andra vuxna vävnader, och uttrycka typiska ytmarkörer såsom CD90, CD105, CD73 1. Dessutom kan de differentiera i flera celltyper, såsom osteoblaster, kondrocyter och adipocyter 3. Deras terapeutiska effekter tillskrivs deras regenerativ och trofiska egenskaper 4. hMSCs skulle kunna användas i ortopedisk kirurgi, såväl som i andra regenerativa kliniska tillämpningar. De är företrädesvis kombineras med byggnadsställningar, för att förbättra det kliniska resultatet 5.
Jämfört med andra material, visar fibringelen intressanta egenskaper, såsom vidhäftningsförmåga, resorption och effektiv transport av näringsämnen, som gör det mycket användbart för en mängd olika vävnadstekniska tillämpningar 6,7.
<p class = "jove_content"> Den största utmaningen i att översätta en tissue engineering strategi i kliniska tillämpningar är att få en fullt biokompatibel och BioSafe byggnadsställning och en xeno fritt odlingsmedium som undviker varje smitt eller reaktiv effekt.I vår metod, fibrin gel, som härrör från patientens eget blod, och autologt serum, för in vitro hMSCs kultur, användes som en möjlig terapeutisk lösning i det ortopediska området 8.
För kliniska ändamål är hMSCs vanligtvis administreras via två huvud förfaranden: (i) förfarandet (dvs minimal manipulation) "ett steg", som gör det möjligt att automatiskt transplantation av benmärg, antingen hela eller koncentrerad (dvs mononukleära celler), under kirurgi; och (ii) förfarandet (dvs omfattande manipulation) "två steg", som bygger på ex vivo expansion av hMSCs att öka deras avkastning före implantering, och kräver GMP faciliteter 9. Interestingly, odling av celler med humant vuxen serum istället för bovint kalvserum tillåter återhämtning tillsammans med hMSCs, av en underuppsättning av celler (1 – 10% i mononukleära kulturer) kallas mesodermala stamceller (MPCs), med förmåga att in vitro differentiering till färskt hMSCs 10,11. Sålunda kan hMPCs spela en betydande roll i den regenerativa processen i jämförelse med enbart 12,13 hMSCs. Slutligen skjuter kortsiktiga osteo-induktion hMSCs att starta sin differentiering i den osteogena linjen utan att förlora sin proliferativ potential och livskraft 12. Dessa resultat bekräftar tidigare studier som har rapporterat förstärkt in vivo benbildning genom hMSCs, följt av en förkultur i osteogen mediet 14. Dessutom kan en autolog plasmakoagel som en ställning för celladministrering med lätthet manipuleras av kirurgen och formas för att passa formen på benkaviteten 13.
therefore, kan denna metod vara mycket användbart för dessa forskare och kliniker som syftar till att översätta deras hMSC-baserad terapi från bänken till säng i ortopediska applikationer.
De kritiska stegen i detta protokoll avser användning av vuxen människa serum och proteas, som gör det möjligt att erhålla en BioSafe hMSC terapi. I synnerhet möjliggör vuxen människa serum isolering och underhåll, medan proteas säkerställer skörden av Medelhavsländerna. Dessa är omogna celler som finns i benmärgen som kan ge upphov till färska hMSCs, vilket säkerställer en reservoar av viabla hMSCs längs odlingstiden. Inte alla MPCs kan samlas in, eftersom en ökning av exponeringstiden till proteasaktiviteten är till förfång för hMSC viabilitet. Av denna anledning var en 10 min proteas inkubation vald som optimal kompromiss mellan återvinning av Medelhavsländerna och livskraft hMSCs. En annan avgörande steg är osteodifferentiation tid. Faktum är att ett omfattande in vitro osteodifferentiation skulle avsevärt minska cellviabiliteten, vilket påverkar den slutliga benbildning in vivo. Den sista kritiska steget består i utnyttjar autolog bioresorberbar byggnadsställning, which erhålls genom att bädda in cellerna (hMSCs och partnerländerna) i en fibrin gel från plasma koagulering.
Ett viktigt steg för att öka utbytet av Medelhavsländerna är att ympa mononukleära celler vid högre koncentration. Genom att använda aferes för att erhålla plasma och behandla den med kalciumglukonat gör det möjligt att uppnå autologt serum i stora mängder. Det har observerats att humant serum som en mediumsupplement är jämförbar med fetalt bovint serum (FBS) i hMSC kulturer. Men i vår erfarenhet, en komplett medium kompletterat med FBS bidrar till snabbare åldrande än vuxen människa serum. Ett viktigt steg är att administrera en minimal osteoinduktion till hMSCs. I själva verket leder denna behandling cellerna att enkelt skilja mot den osteogena linjen, vilket är användbart för att undvika ytterligare celltransformation in vivo. För att upprätthålla en god lönsamhet för minimalt osteoinduced hMSCs, rekommenderas att följa noga rekommendationerna som beskrivs i steg 6,5. end 8,2., inklusive hantering, centrifugering och medel belopp som skall läggas till. Om ett förfarande aferes inte är tillgänglig, är det fortfarande möjligt att genomföra detta protokoll genom att utföra flera bloddragningar till patienten eller, i andra hand, genom att köpa poolade AB sera. Självklart, för att få detta protokoll från bänken till säng, är det obligatoriskt att ha GMP cellfabriker, eller motsvarande, tillgängliga.
Begränsningar för tillämpningen av denna teknik avser anemiska, hematologiska-onkologi och ortopediska patienter som drabbats av osteomyelit., Teckning stora mängder blod från anemiska patienter, bör undvikas. I onkologiska patienter, är kvaliteten på cellprover påverkas av cellgiftsbehandling, medan osteomyelit patienter infektion kan påverka slutresultatet. I samtliga fall där den autologa serum är otillräcklig eller olämpligt, poolade manliga AB sera utgör ett bra alternativ.
Använda cell / fibrin CLOt konstruktioner för eventuella kliniska tillämpningar är avgörande för att släppa en helt autologa cellterapi, som kan vara lätt att hantera och mögel under operation, vilket resulterar i utmärkta resultat för att behandla skelett icke-förbund 13. För kliniska ändamål är hMSCs vanligen administreras via två huvudförfaranden: minimal manipulation och omfattande manipulation 9. För att övervinna problemen i samband med en omfattande ex vivo kultur, såsom avvikelser i cellmorfologi och storlek 18, utförde vi en kort tid ex vivo cellexpansion och osteo-differentiering (endast 4 d).
Xeno fria protokoll som beskrivs i detta dokument, tillsammans med de korta expansions- och osteodifferentiation cell gånger, visat sig vara relevant i kliniker för att erhålla snabb produktion ben in vivo, utan några tecken på vävnads överväxt och transformation, vilket bekräftar dess effektivitet och lång -term säkerhet i benreparation (Figur 5) </strong> 13.
Den metod som presenteras i denna rapport syftar till att visa effekt och säkerhet av hMSC in vitro expansion i autologa villkor för eventuell användning i ortopedisk kirurgi. Detta protokoll använder hMSCs isolerade från benmärg och odlas i ett medium kompletterat med autologt serum och bäddas in i autologa fibrinkoagel, vilket säkerställer en helt autolog cellterapi. Den två-faldig osteogen induktion, strax innan det andra lösgörande, förbättrar hMSC förmågan att differentiera till osteoblaster. Som ett resultat, är särskilt lämplig för applikationer i bendefekter denna teknik, eftersom det inte är begränsat till pseudartros. Möjliga framtida tillämpningar kan innebära talus cysta och benförlust hantering.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.
Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
DMEM-LG, no glut, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
Glutamax (100X) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
Penicillin Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
Microtome | Leika | histological assay | |
May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |