Одноклеточный экспрессии генов с помощью Multiplex RT-КПЦР к характеризации гетерогенности редких популяций лимфоидных
Summary
Этот протокол описывает, как оценить экспрессию большого массива генов на клоновых уровне. Одноклеточный RT-КПЦР производит весьма надежные результаты с сильной чувствительностью для сотен образцов и генов.
Abstract
Экспрессия генов гетерогенность является интересной особенностью для изучения лимфоидных популяций. экспрессии генов в этих клетках изменяется в процессе активации клеток, стресса или раздражения. Выражение мультиплекс ген Одноклеточный позволяет одновременно оценку десятков генов 1, 2, 3. На уровне одноклеточных, мультиплекс экспрессия генов определяет население гетерогенность 4, 5. Это позволяет проводить различия неоднородности населения путем определения как вероятное сочетание различных стадий предшественников среди зрелых клеток, а также разнообразие ответов клетки на раздражители.
Врожденные лимфоидных клеток (ILC) были недавно описаны как совокупность врожденных эффекторы иммунного ответа 6, 7. В этом протоколе клетка гетерогенность ILC онpatic отсек исследуется в течение гомеостаза.
В настоящее время наиболее широко используемый метод для оценки экспрессии гена RT-КПЦР. Это выражение гена измеряет метод только один ген, в то время. Кроме того, этот метод не может оценить гетерогенность экспрессии генов, так как множественные клетки необходимы для одного теста. Это приводит к измерению средней экспрессии генов популяции. При оценке большого количества генов, RT-КПЦР становится по времени, reagent-, и образец затрат метод. Следовательно, компромиссы ограничить число генов или клеточных популяций, которые могут быть оценены, увеличивая риск упустить глобальную картину.
Эта рукопись описывает, как одноклеточные мультиплексной ОТ-КПЦР может быть использован для преодоления этих ограничений. Этот метод извлек выгоду из недавней микрофлюидики технологических достижений 1, 2. Реакции, происходящие в мультиплекс RT-КПЦР чипы не отлEed на nanoliter уровне. Следовательно, экспрессия генов одноклеточных, а также одновременное выражение множественный ген, может быть выполнена в reagent-, ственном образце, и экономически эффективным образом. Можно протестировать ген клеток подписи гетерогенность на клонального уровне между клеточными подмножествах в популяции на разных стадиях развития или в разных условиях , 4, 5. не Работая на редких популяций с большим числом условий на уровне одной клетки больше не является ограничением.
Introduction
За последние несколько лет, врожденные лимфоидные клетки (КМО), так как все больше и больше исследованы. Несмотря на отсутствие антиген-специфических рецепторов, они принадлежат к лимфоидного и представляют собой важные сторожей для гомеостаза тканей и воспаления. КМО в настоящее время разделены на три группы в зависимости от их экспрессии специфических комбинаций факторов транскрипции и на их способности продуцировать цитокины , 6, 7.
КМО способствуют многочисленные гомеостаза и патофизиологических ситуаций в различных органах через конкретного производства цитокина 8, 9. Для того, чтобы быть в состоянии понять роль этих клеток, важно, чтобы определить различные ILC субпопуляции за орган и определить их отношения в области развития. Кроме того, явления пластичности между различными подмножествами были связаны между собой. Изучая гетерогенностьиз клеток, присутствующих в одном органе, можно разграничить стадии их созревания и различать их специфические функции.
Чтобы проиллюстрировать технику одноклеточного мультиплексной ОТ-кПЦР, печеночные КМО были выбраны, с особым акцентом на их неоднородности в пределах одной группы ILC (тип 1 ILC) 10. Во-первых, за счет использования проточной цитометрии, три различных ILC популяции характеризуются в печени. Группа 1 МКТ представляет около 80% врожденных эффекторов, в то время как две другие группы населения являются редкими печеночные ILC популяции (менее 5% от всех врожденных эффекторов). Эти группы населения были отсортированный с использованием широко экспрессируется клетками поверхностных маркеров ILC популяций. В результате, отсортированный ILC популяции в печени широко смотреть похожи одна на другую.
Одноклеточный мультиплекс RT-КПЦР стала одним из лучших методов , чтобы оперативно расследовать разнородность этих групп населения 11 </sвверх>. Две основные характеристики определяются воспользовавшись одноклеточного мультиплекс техники RT-КПЦР. Во-первых, глядя на клонального уровне, то можно восстановить экспрессию генов клеточного специфичные для сравнения между клетками, которые, по-видимому выглядеть примерно стадии развития. Затем, посмотрев на заранее выбранной комбинации экспрессии генов, мы будем определять новые сигнатуры генов на основе одновременных паттернов экспрессии генов в один момент времени. Эти аспекты позволить сбор широкого спектра данных выражение для большого количества клеток, даже в редких популяций, так как этот метод выполняется на клонального уровне. Таким образом, МКТ гетерогенность в печени может быть адекватно оценена.
Далее, путем перебора всех клеток с глобальной ILC фенотипа, широкий обзор экспрессии нескольких генов печени ILC популяций получается, несмотря на то, что они представляют собой крайне редкие популяции. Чип Микрожидкостных на основе позволяет экспериментировать даже снебольшое количество клеточного материала. Как следствие, могут быть получены профили экспрессии генов в популяциях редких клеток. С помощью онлайн программного обеспечения для анализа генов подписи, кластеры клеточной популяции и потенциальные отношения клеток могут быть исследованы. Следовательно, функциональные тесты могут быть выполнены для проверки данных кластеризации на уровне в естественных условиях.
Десятки экспрессии генов могут быть оценены одновременно на сотни или более отдельных клеток на том же чипе 3, 11, 12. Дизайн анализа является самой длинной и самой важной частью эксперимента. Определение генов, имеющих отношение к проверяемой гипотезы имеет первостепенное значение для получения соответствующих результатов. Во-вторых, необходимы внутреннего контроля (например, известных поверхностных маркеров, используемых для сортировки) и конкретные меры контроля. Это очень важно, чтобы проверить праймера амплификации специфичность, эффективность амплификации, а Тон отсутствие конкуренции праймера. Таким образом, работа с одноклеточной мультиплексной ОТ-кПЦР является экономия времени методика, как и выражение нескольких генов клетки оценивается в то же время.
Используя тот же чип и смесь реагентов для всех ячеек ограничивает возможные ошибки манипуляций и позволяет воспроизводимости между образцами. В целом, различные аспекты одноклеточного мультиплексной ОТ-кПЦР позволяет производить высоконадежных результатов на клонального уровне, с большим уровнем чувствительности для широкого спектра образцов и генов. Полученные результаты предлагают мощные и надежные данные для биостатистических испытаний.
Это может быть достигнуто за счет микрожидком аспекте способа, который позволяет для работы на очень малых количеств материала и приводит к исчерпывающих результатов. И, наконец, с помощью онлайн программного обеспечения, можно сравнить желательные популяции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает, как получить исчерпывающую информацию экспрессии генов на уровне клонального. Здесь мы исследовали печени ILC отделения гетерогенность. После сортировки одноклеточного различных ILC популяций (на основе широко экспрессируется ILC поверхностных маркеров), образц…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue – inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells – a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a., Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
