Una sola célula de la expresión génica utilizando multiplex RT-qPCR para caracterizar heterogeneidad de las poblaciones linfoides Raras
Summary
Este protocolo describe la forma de evaluar la expresión de una gran variedad de genes a nivel clonal. Una sola célula de RT-qPCR produce resultados altamente fiables con una fuerte sensibilidad para cientos de muestras y los genes.
Abstract
la heterogeneidad de la expresión génica es una característica interesante investigar en poblaciones linfoides. La expresión génica en estas células varía durante la activación celular, el estrés, o la estimulación. Una sola célula de la expresión génica multiplex permite la evaluación simultánea de decenas de genes 1, 2, 3. A nivel de una sola célula, la expresión de genes múltiplex determina heterogeneidad de la población 4, 5. Se permite la distinción de heterogeneidad de la población mediante la determinación tanto de la mezcla probable de diversas etapas precursoras entre células maduras y también la diversidad de respuestas de las células a los estímulos.
Células linfoides innatas (CIT) se han descrito recientemente como una población de efectores innatos de la respuesta inmune 6, 7. En este protocolo, la heterogeneidad celular de la CIT secompartimento Patic se investigó durante la homeostasis.
En la actualidad, la técnica más utilizada para evaluar la expresión génica es la RT-qPCR. Esta expresión de genes método mide sólo un gen a la vez. Además, este método no puede estimar la heterogeneidad de la expresión génica, ya que se necesitan varias celdas para una prueba. Esto conduce a la medición de la expresión génica media de la población. Al evaluar un gran número de genes, RT-qPCR se convierte en un tiempo-, y el método reagent-, muestra que consume. Por lo tanto, las ventajas y desventajas limitan el número de genes o poblaciones de células que pueden ser evaluados, lo que aumenta el riesgo de perder la visión global.
Este manuscrito describe cómo multiplex de una sola célula RT-qPCR se puede utilizar para superar estas limitaciones. Esta técnica se ha beneficiado de los avances tecnológicos recientes microfluidos 1, 2. Las reacciones que se producen en multiplex chips de RT-qPCR no lo hacen excEED el nivel de nanolitros. Por lo tanto, la expresión de genes de una sola célula, así como la expresión de múltiples genes simultánea, se pueden realizar en un reagent-, muestra-, y de manera rentable. Es posible probar génica de células firma heterogeneidad a nivel clonal entre subconjuntos de células dentro de una población en diferentes etapas de desarrollo o en condiciones diferentes 4, 5. Trabajando en las poblaciones raras con un gran número de condiciones a nivel de una sola célula ya no es una restricción.
Introduction
En los últimos años, las células linfoides innatas (ILC) se han investigado cada vez más. A pesar de su falta de receptores específicos de antígeno, que pertenecen al linaje linfoide y representan centinelas importantes para la homeostasis de los tejidos y la inflamación. CIL se divide actualmente en tres grupos basados en su expresión de combinaciones específicas de factores de transcripción y de su capacidad para producir citocinas 6, 7.
ILC contribuyen a numerosas situaciones homeostáticos y fisiopatológicos en diversos órganos a través de la producción de citoquinas específicas 8, 9. Para poder entender el papel de estas células, es importante para determinar las diferentes subpoblaciones de la CDI por órganos e identificar sus relaciones de desarrollo. Además, los fenómenos de plasticidad entre los diferentes subconjuntos se han relacionado. Mediante el estudio de la heterogeneidadde las células presentes en un órgano, es posible delimitar su etapa de maduración y para distinguir sus funciones específicas.
Para ilustrar la técnica de multiplexación de una sola célula de RT-qPCR, las CIL hepáticas fueron elegidos, con un énfasis particular en su heterogeneidad dentro del mismo grupo CIT (CIT tipo 1) 10. En primer lugar, mediante el uso de citometría de flujo, tres poblaciones distintas de la CIT se caracterizaron en el hígado. Grupo 1 CIT representa alrededor del 80% de los efectores innatos, mientras que las otras dos poblaciones son las poblaciones de la CDI hepáticas raras (menos del 5% de los efectores innatos). Esas poblaciones fueron ordenados usando ampliamente expresadas marcadores de la superficie celular de las poblaciones de la CDI. Como resultado, las poblaciones ordenadas CIT en el hígado miran uno similar en términos generales a otro.
Múltiplex de una sola célula de RT-qPCR ha emergido como una de las mejores técnicas para investigar con prontitud a la heterogeneidad de estas poblaciones 11 </sarriba>. Dos características principales se determinan tomando ventaja de la multiplex de una sola célula técnica de RT-qPCR. En primer lugar, al ver el nivel clonal, es posible recuperar la expresión génica específica de la célula para la comparación entre las células que aparentemente muestran etapas de desarrollo similares. Entonces, al ver una combinación preseleccionada de la expresión génica, vamos a determinar nuevas firmas de genes sobre la base de los patrones de expresión de genes de forma simultánea en un punto de tiempo. Estos aspectos permiten la recogida de una gran variedad de datos de expresión de un gran número de células, incluso en poblaciones raras, ya que la técnica se realiza a nivel clonal. De esta manera, la heterogeneidad CIT en el hígado se puede evaluar de manera adecuada.
A continuación, por clasificación de todas las células con un fenotipo ILC global, se obtiene una amplia visión general de la expresión de múltiples genes de las poblaciones de la CIT del hígado, a pesar de que representan poblaciones extremadamente raros. Un chip basada en la microfluídica permite la experimentación con inclusouna pequeña cantidad de material celular. Como consecuencia, los perfiles de expresión génica de las poblaciones de células raras se pueden obtener. El uso de software en línea de la firma de análisis de genes, núcleos de población de células y las relaciones celulares potenciales pueden ser investigados. En consecuencia, las pruebas funcionales pueden llevarse a cabo para validar los datos de agrupación a nivel in vivo.
Decenas de expresiones de genes podrían evaluarse de forma concomitante en cientos o más células individuales en el mismo chip 3, 11, 12. Diseño del ensayo es la parte más larga y más importante del experimento. La determinación de los genes correspondientes a la hipótesis de que ser probado es de suma importancia para obtener resultados relevantes. En segundo lugar, se necesita un control interno (tales como marcadores de superficie conocidos utilizados para la clasificación) y controles específicos. Esto es crucial para probar la especificidad de amplificación de cebador, la eficiencia de la amplificación, y tque la ausencia de competencia de imprimación. Por lo tanto, trabajando con multiplex de una sola célula RT-qPCR es una técnica de ahorro de tiempo, ya que la expresión de genes múltiples de una célula se evalúa al mismo tiempo.
Usando el mismo chip y mezcla de reactivos para todas las células limita los posibles errores de manipulación y permite la reproducibilidad entre las muestras. En total, los diferentes aspectos de multiplex de una sola célula RT-qPCR permite la producción de resultados altamente fiables a nivel clonal, con un gran nivel de sensibilidad para una amplia variedad de muestras y genes. Los resultados obtenidos ofrecen datos potentes y robustos para pruebas bioestadísticos.
Esto se puede lograr debido al aspecto de microfluidos del método, lo que permite para el trabajo en muy pequeñas cantidades de material y conduce a resultados exhaustivos. Por último, el uso de software en línea, es posible comparar las poblaciones deseadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se describe cómo obtener información exhaustiva de la expresión génica a nivel clonal. A continuación, se investigó la heterogeneidad de hígado CIT compartimento. Después de la clasificación de una sola célula de diferentes poblaciones de la CDI (basados en marcadores de la superficie de la CDI ampliamente expresados), las muestras fueron pre-amplificadas por los genes preseleccionados específicos. Entonces, el ADNc y los cebadores obtenida se cargaron en un chip microfluídico multiplex …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
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