Summary

ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

Published: January 19, 2017
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את הביטוי של מגוון רחב של גנים ברמה המשובטת. RT-qPCR מתחיל מתא בודד מייצר תוצאות אמינות ביותר עם רגישות חזקה במשך מאות דגימות וגנים.

Abstract

ההטרוגניות התבטאות גנים היא סממן מעניין שמן הראוי לחקור באוכלוסיות הלימפה. התבטאות גנים בתאים אלה משתנה במהלך תא ההפעלה, מתח, או גירוי. ביטוי גנים זמנית מתא בודד מאפשר הערכה סימולטני של עשרות 1 גנים, 2, 3. ברמה מתא בודד, ביטוי גנים זמנית קובע האוכלוסייה ההטרוגניות 4, 5. היא מאפשרת את ההבחנה של ההטרוגניות אוכלוסייה על ידי קביעה הוא התמהיל הסביר של שלבי מבשר מגוונים בין תאי בוגרים וגם המגוון של תגובות תא לגירויים.

תאי הלימפה מולדים (ILC) תוארו לאחרונה כאוכלוסייה של effectors מולד של התגובה החיסונית 6, 7. בפרוטוקול זה, ההטרוגניות התא של הוא ILCתא patic נחקר במהלך הומאוסטזיס.

נכון לעכשיו, את הטכניקה הנפוצה ביותר להעריך ביטוי גנים היא RT-qPCR. ביטוי גני אמצעי שיטה זו רק גן אחד בכל פעם. בנוסף, שיטה זו אינה יכולה להעריך ההטרוגניות של ביטוי גנים, מאז מספר תאים נדרשים עבור מבחן אחד. זה מוביל את המדידה של ביטוי גנים הממוצע של האוכלוסייה. בהערכת מספר גדול של גנים, RT-qPCR הופך הזמן-, reagent-, ושיטת רב-המדגם. לפיכך, את יחסי הגומלין להגביל את מספר גנים או אוכלוסיות תאים כי ניתן להעריך, מעלה את הסיכון של חסר בתמונה הגלובלית.

כתב יד זה מתאר כיצד זמנית תא בודד RT-qPCR ניתן להשתמש כדי להתגבר על המגבלות האלה. טכניקה זו נהנתה התקדמות טכנולוגית מיקרופלואידיקה האחרונה 1, 2. תגובות המתרחשות זמנית שבבי RT-qPCR לא EXCeed ברמת nanoliter. לפיכך, ביטוי גני תא בודד, כמו גם ביטוי גנים מרובה בו זמנית, ניתן לבצע בתוך reagent-, sample-, ואופן חסכוני. אפשר לבדוק ההטרוגניות חתימת גן התא ברמה המשובטת בין תת תא בתוך אוכלוסייה בשלבי התפתחותיים שונים או בתנאים שונים 4, 5. עבודה על אוכלוסיות נדירות עם מספר גדול של תנאים ברמה מהתא הבודד הוא כבר לא מגבלה.

Introduction

במהלך השנים האחרונות, תאי הלימפה מולד (ILCs) נחקרו יותר ויותר. למרות חוסר קולטנים אנטיגן ספציפי, הם שייכים שושלת הלימפה ולייצג זקיפים חשובים הומאוסטזיס לרקמות ודלקת. ILCs כיום מחולקים לשלוש קבוצות על בסיס הביטוי שלהם שילובים גורם שעתוק ספציפיים על יכולתם לייצר ציטוקינים 6, 7.

ILCs מובילים למצבים ההומיאוסטטית ו pathophysiological רבים באיברים מגוונים באמצעות ציטוקינים ספציפיים ייצור 8, 9. כדי להיות מסוגל להבין את התפקיד של תאים אלה, חשוב לקבוע את תת-אוכלוסיות ILC השונות לכל איבר ולזהות קשרי ההתפתחות שלהם. בנוסף, תופעות של פלסטיות בין תת השונים נקשרו. על ידי לימוד הטרוגניותשל תאים הנמצאים איבר אחד, אפשר לתחום הבמה של התבגרות שלהם להבחין הפונקציות הספציפיות שלהם.

כדי להמחיש את הטכניקה של תא בודד זמנית RT-qPCR, ILCs הכבד נבחר, עם דגש מיוחד על ההטרוגניות שלהם בתוך אותה קבוצת ILC (סוג 1 ILC) 10. ראשית, באמצעות שימוש cytometry זרימה, שלוש אוכלוסיות ILC ברורים התאפיינו בכבד. הקבוצה 1 ILC מייצג כ 80% של effectors הטבעי תוך שתי האוכלוסיות האחרות הן אוכלוסיות ILC כבדות נדירות (פחות מ -5% של effectors המולדת). אלה אוכלוסיות מוינו באמצעות סמנים על פני קרום התא ביטוי נרחב של אוכלוסיות ILC. כתוצאה מכך, מסודר אוכלוסיות ILC בכבד להסתכל אחד דומה במידה רבה אחר.

זמנית מתא בודד RT-qPCR התפתחה אחת הטכניקות הטובות ביותר כדי לחקור את ההטרוגניות ללא דיחוי על אוכלוסיות אלה 11 </sעד>. שני מאפיינים עיקריים נקבעים על ידי ניצול של טכניקת תא הבודד זמנית RT-qPCR. ראשית, על ידי הסתכלות על רמת המשובטים, אפשר לשחזר ביטוי גנים תא ספציפי להשוואה בין תאים שכנראה להציג שלבי ההתפתחות דומה. לאחר מכן, ע"י הסתכלות שילוב שנבחר מראש של ביטוי גנים, נוכל לקבוע חתימות גן חדשות המבוססת על דפוסי ביטוי גנים בו זמנית בנקודת זמן אחת. היבטים אלה מאפשרים גביית מגוון רחב של נתונים הביטוי עבור מספר גדול של תאים, אפילו על אוכלוסיות נדירות, מאז הטכניקה מבוצעת ברמה המשובטת. ובכך, ההטרוגניות ILC בכבד ניתן להעריך כראוי.

לאחר מכן, על ידי מיון כל התאים עם פנוטיפ עולמי ILC, סקירה רחבה של הביטוי המרובה הגן של האוכלוסיות הכבדות ILC מתקבלת, למרות שהם מייצגים אוכלוסיות נדירות ביותר. שבב מבוסס microfluidic מאפשר התנסות אפילוכמות קטנה של חומר תא. כתוצאה מכך, פרופילי ביטוי גנים של אוכלוסיות תאים נדירות ניתן להשיג. באמצעות תוכנת ניתוח חתימת הגן באינטרנט, אשכולות אוכלוסיית תאים ומערכות יחסים תא פוטנציאליים יכולים להיחקר. כתוצאה מכך, ניתן לבצע בדיקות פונקציונליות כדי לאמת את נתוני אשכולות ברמת vivo.

עשרות ביטויי גנים ניתן להעריך בו זמנית על מאה או תאים בודדים יותר על אותו השבב 3, 11, 12. עיצוב של assay הוא החלק הארוך ביותר והחשוב ביותר של הניסוי. הקביעה של הגנים הרלוונטיים להשערה להיבדק היא בעל חשיבות עליונה כדי לקבל תוצאות רלוונטיות. שנית, בקרה פנימית (כגון משטח סמנים ידועים הנמצאים בשימוש למיון) ובקרות ספציפיות נדרשות. זה חיוני כדי לבדוק את הספציפיות הגברת פריימר, את היעילות של ההגברה, ו- Tהוא היעדר תחרות פריימר. לכן, עבודה עם רב מפלסי תא בודד RT-qPCR היא טכניקה חיסכון בזמן, כביטוי-גן המרובה של תא נבחן בעת ​​ובעונה האחת.

שימוש באותו שבב ותמהיל ריאגנטים עבור כל התאים מגביל את השגיאות האפשריות של מניפולציה ומאפשר שחזור בין דגימות. בסך הכל, את ההיבטים השונים של תא בודד זמנית RT-qPCR מאפשרים לייצור תוצאות האמינות ביותר ברמה המשובטת, עם רמה גדולה של רגישות למגוון רחב של דוגמאות וגנים. התוצאות שהתקבלו להציע נתונים חזקים ויציבים לבדיקות biostatistical.

זו יכולה להיות מושגת בשל היבט microfluidic של השיטה, המאפשרת עבודה על כמויות קטנות מאוד של חומר ומובילה לתוצאות ממצות. לבסוף, בעזרת תוכנה באופן מקוון, אפשר להשוות את האוכלוסיות הרצויות.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו של ידי הוועדה לבטיחות מכון פסטר בהתאם משרד החקלאות הצרפתי ואת הנחיות האיחוד האירופי. 1. הכינו צלחת אחת תאים מיון היטב 96 הכינו תערובת טרום הגברה צינור 1.5 מ"ל על י?…

Representative Results

אוכלוסיות הלימפה להציג מגוון גדול בביטוי גנים. בפרוטוקול זה, ההטרוגניות תא כבד ILC נחקרו באמצעות ביטוי גני תא בודד זמנית RT-qPCR. שלא כמו טכניקות ביטוי גנים אחרים, רב מפלסי תא בודד ביטוי גנים RT-qPCR מאפשר עבודה על אוכלוסיות שונות, אפילו הנדירים, בעת ובעונה א…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג מידע ביטוי גנים ממצה ברמה המשובטת. הנה, חקרנו ההטרוגניות תא כבדות ILC. לאחר מיון תא הבודד של אוכלוסיות ILC שונות (המבוססות על משטח סמני ILC ביטוי נרחב), דגימות מראש מוגברות עבור גנים שנבחרו מראש ספציפיים. לאחר מכן, cDNA ו פריימרים השיג הועמסו על גבי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

Materials

Cells Direct One Step qRT-PCR kit Applied Biosystems  11753100 Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme.
Low TE EDTA Buffer Affymetrix 75793 100ML
96-well plates Thermofisher Scientific AB 1100 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling
Cover film Dominique Dutscher 106570 aluminium cover film; avoid contamination and evaporation
Actb Thermofisher Scientific Mm00607939_s1 20X primer
Aes Thermofisher Scientific Mm01148854_s1 20X primer
Ahr Thermofisher Scientific Mm00478932_s1 20X primer
Bcl2 Thermofisher Scientific Mm00477631_s1 20X primer
c-myc Thermofisher Scientific Mm00487804_s1 20X primer
Cbfb Thermofisher Scientific Mm01251026_s1 20X primer
Cd27 Thermofisher Scientific Mm01185212_s1 20X primer
Cd49a Thermofisher Scientific Mm01306375_s1 20X primer
CD49b Thermofisher Scientific Mm00434371_s1 20X primer
Cxcr5 Thermofisher Scientific Mm00432086_s1 20X primer
Cxcr6 Thermofisher Scientific Mm02620517_s1 20X primer
Eomes Thermofisher Scientific Mm01351985_s1 20X primer
Ets1 Thermofisher Scientific Mm01175819_s1 20X primer
Foxo1 Thermofisher Scientific Mm00490672_s1 20X primer
Gapdh Thermofisher Scientific Mm03302249_s1 20X primer
Gata3 Thermofisher Scientific Mm00484683_s1 20X primer
Gm-csf Thermofisher Scientific Mm01136644_s1 20X primer
Hes1 Thermofisher Scientific Mm01342805_s1 20X primer
Hprt Thermofisher Scientific Mm00446968_s1 20X primer
Id2 Thermofisher Scientific Mm01293217_s1 20X primer
Il-12rb2 Thermofisher Scientific Mm00711781_s1 20X primer
Il-18r1 Thermofisher Scientific Mm00515178_s1 20X primer
Il-1rl1 Thermofisher Scientific Mm00434237_s1 20X primer
Il-22 Thermofisher Scientific Mm001226722_s1 20X primer
Il-23r Thermofisher Scientific Mm00519943_s1 20X primer
Il-2ra Thermofisher Scientific Mm01340213_s1 20X primer
Il-2rb Thermofisher Scientific Mm01195267_s1 20X primer
IL-7r Thermofisher Scientific Mm00434295_s1 20X primer
Klr5 Thermofisher Scientific Mm04207528_s1 20X primer
Lef1 Thermofisher Scientific Mm00550265_s1 20X primer
Ncr1 Thermofisher Scientific Mm01337324_s1 20X primer
Nfil3 Thermofisher Scientific Mm01339838_s1 20X primer
Notch1 Thermofisher Scientific Mm00435249_s1 20X primer
Notch2 Thermofisher Scientific Mm00803069_s1 20X primer
Rora Thermofisher Scientific Mm01173766_s1 20X primer
Rorc Thermofisher Scientific Mm01261022_s1 20X primer
Runx3 Thermofisher Scientific Mm00490666_s1 20X primer
Tbx21 Thermofisher Scientific Mm01299453_s1 20X primer
Tcf3 Thermofisher Scientific Mm01175588_s1 20X primer
Tcf7 Thermofisher Scientific Mm00493445_s1 20X primer
Tle1 Thermofisher Scientific Mm00495643_s1 20X primer
Tle3 Thermofisher Scientific Mm00437097_s1 20X primer
Tsc22d3 Thermofisher Scientific Mm01306210_s1 20X primer
Tnfrsf11a Thermofisher Scientific Mm00437132_s1 20X primer
Tox Thermofisher Scientific Mm00455231_s1 20X primer
Zbtb16 Thermofisher Scientific Mm01176868_s1 20X primer
Zbtb7b Thermofisher Scientific Mm00784709_s1 20X primer
qPCR Master mix  Applied BioSystems P/N 4304437
2X Assay Loading Reagent Fluidigm P/N 85000736 Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. 
2X Sample Loading Reagent Fluidigm P/N 85000735 Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. 
48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip Fluidigm BMK-M-48.48 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction
48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller Fluidigm 89000020 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers
mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler Fluidigm GE48.48 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler
96-well plates Thermofisher Scientific AB 1100 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling
C57Bl/6 mice Janvier C57Bl/6 miceJ@RJ
10 mL syringe BD Biosciences 309639
PBS Life Technologies 14040174
HBSS Life Technologies 24020133
RPMI Life Technologies 61870044
FCS CVFSVF000U Eurobio Abcys Standard fœtal calf serum
Potter tube N/A
15 mL tube Corning 352097
1.5 mL tube Sigma-Aldrich T9661-1000EA
Facs machine N/A
centrifuge  Thermofisher Scientific 75004538
1000 µL tips Fisher Scientific 10313272
P1000  Gilson F123602
Percoll Dominique Dutscher 17-0891-01
Facs tube Falcon 352235
anti-CD8 Biotin mouse antibody Sony 1103520 lineage antibody
anti-CD19 Biotin mouse antibody Sony 1177520 lineage antibody
anti-TCRab Biotin mouse antibody BioLegend 109204 lineage antibody
anti-TCRgd Biotin mouse antibody BD Biosciences 553176 lineage antibody
anti-Ter119 Biotin mouse antibody BD Biosciences 553672 lineage antibody
anti-Gr1 Biotin mouse antibody BD Biosciences 553125 lineage antibody
anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody BioLegend 109828
anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody ebioSciences 25-1271-82
anti-CD3 BV510 mouse antibody BD Biosciences 563024
anti-CD4 BV786 mouse antibody BD Biosciences 563727
anti-NKp46 PE mouse antibody ebioSciences 12-3351-82
Streptavidin Sony 2626025
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML
Electronic pipette Eppendorf 4986000017
Combitips 0.1 mL Eppendorf 30089405
Multichannel pipette Rainin L8-10XLS+
Accudrop BD Biosciences 345249 verification beads for FACS

References

  1. Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
  2. Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  3. Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
  4. Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
  5. Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue – inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
  6. Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells – a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
  7. Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
  8. Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
  9. Monticelli, L. a., Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
  10. Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
  11. Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
  12. Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
  13. Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
  14. Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
  15. Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
  16. Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).

Play Video

Cite This Article
Perchet, T., Chea, S., Hasan, M., Cumano, A., Golub, R. Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations. J. Vis. Exp. (119), e54858, doi:10.3791/54858 (2017).

View Video