Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression einer großen Reihe von Genen auf der klonalen Ebene zu bewerten. Einzellige RT-qPCR produziert höchst zuverlässige Ergebnisse mit einer starken Empfindlichkeit für Hunderte von Proben und Gene.
Abstract
Die Genexpression Heterogenität ist ein interessantes Feature in lymphatischen Populationen zu untersuchen. Genexpression in diesen Zellen variiert während der Zellaktivierung, Stress oder Stimulation. Einzelzell – multiplex Genexpression ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung von zehn Gene 1, 2, 3. Auf der Ebene einzelner Zellen, Multiplex – Genexpression bestimmt Bevölkerung Heterogenität 4, 5. Es ermöglicht die Unterscheidung der Bevölkerungs Heterogenität durch sowohl die wahrscheinliche mix von unterschiedlichen Vorstufen unter reifen Zellen und auch die Vielfalt von Zellantworten auf Stimuli zu bestimmen.
Angeborene lymphatischen Zellen (ILC) wurden als eine Population der angeborenen Effektoren der Immunantwort 6, 7 kürzlich beschrieben. In diesem Protokoll Zell Heterogenität der ILC erPatic Fach wird während der Homöostase untersucht.
Derzeit ist die am weitesten verbreitete Technik Genexpression zu bewerten ist RT-qPCR. Bei dieser Methode wird die Genexpression nur ein Gen zu einem Zeitpunkt. Darüber hinaus kann dieses Verfahren nicht Heterogenität der Genexpression abzuschätzen, da mehrere Zellen für einen Test benötigt werden. Dies führt zu der Messung des mittleren Genexpression der Bevölkerung. Wenn eine große Zahl von Genen, die Beurteilung, RT-qPCR wird ein zeit-, reagenzien und Probenaufwändige Methode. Daher begrenzen die Trade-offs, die Anzahl der Gene oder Zellpopulationen, die ausgewertet werden können, wodurch das Risiko von der globalen Bild fehlt.
Diese Handschrift beschreibt, wie Einzelzellen-Multiplex-RT-qPCR verwendet werden können, um diese Beschränkungen zu überwinden. Diese Technik wurde von den letzten Mikrofluidik technologischen Fortschritt profitiert 1, 2. Reaktionen auftreten in Multiplex-RT-qPCR-Chips nicht EXCNano–Ebene eed. Daher können Einzelzell Genexpression sowie gleichzeitige multiple Genexpression in einer reagenziendurchgeführt werden, Proben- und kostengünstige Weise. Es ist möglich , Zellen Gen – Signatur Heterogenität an der klonalen Ebene zwischen den Zell – Untergruppen in einer Population in verschiedenen Entwicklungsstadien oder unter verschiedenen Bedingungen 4, 5 zu testen. Die Arbeit an seltenen Populationen mit einer großen Anzahl von Bedingungen auf der Ebene einzelner Zellen ist nicht mehr eine Einschränkung.
Introduction
In den letzten Jahren, angeborene lymphatischen Zellen (ILC) wurden zunehmend untersucht. Trotz ihres Mangels an antigenspezifischen Rezeptoren, sie gehören zu der lymphoiden Abstammungslinie und stellen wichtige sentinels für Gewebe-Homöostase und Entzündung. ILCs werden derzeit in drei Gruppen unterteilt auf der Grundlage ihrer Expression spezifischer Transkriptionsfaktor – Kombinationen und auf ihrer Fähigkeit , Cytokine 7 6, zu erzeugen.
ILCs tragen zu zahlreichen Homöostase und pathophysiologischen Situationen in den verschiedenen Organen über spezifische Zytokin – Produktion 8, 9. Um die Rolle dieser Zellen zu verstehen, ist es wichtig, die verschiedenen Subpopulationen ILC pro Organ zu bestimmen und deren Entwicklungsbeziehungen zu identifizieren. Zusätzlich wurden Phänomene der Plastizität zwischen den verschiedenen Untergruppen verwandt. Durch die Heterogenität des Studiumsder Zellen, die in einem Organ, ist es möglich, die Reifungsstufe zu begrenzen und ihre spezifischen Funktionen zu unterscheiden.
Um die Technik der Single-Cell – Multiplex – RT-qPCR illustrieren, wurden Leber ILCs gewählt, mit einem besonderen Schwerpunkt auf ihre Heterogenität innerhalb der gleichen ILC Gruppe (Typ 1 ILC) 10. Zuerst wird durch die Verwendung von Durchflusszytometrie, drei verschiedene ILC-Populationen wurden in der Leber gekennzeichnet. Gruppe 1 ILC entspricht rund 80% der angeborenen Effektoren, während die beiden anderen Populationen sind selten Leber ILC Populationen (weniger als 5% der angeborenen Effektoren). Diese Populationen wurden unter Verwendung allgemein ausgedrückt Zelloberflächenmarker von ILC Populationen sortiert. Als Ergebnis sortiert ILC-Populationen in der Leber weitgehend ähnlich aussehen einem zum anderen.
Einzellige Multiplex – RT-qPCR hat sich als eine der besten Techniken entstanden, umgehend die Heterogenität dieser Populationen 11 untersuchen </sup>. Zwei Hauptmerkmale werden bestimmt, indem die Vorteile der Single-Cell-Multiplex-RT-qPCR-Technik nehmen. Erstens, indem auf der klonalen Ebene sucht, ist es möglich, zellspezifischen Genexpression für einen Vergleich zwischen den Zellen, die offenbar zeigen ähnliche Entwicklungsstadien zu erholen. Dann wird durch bei einer vorgewählten Kombination von Genexpressions suchen, werden wir neue Gensignaturen basierend auf simultanen Genexpressionsmuster zu einem Zeitpunkt bestimmen. Diese Aspekte ermöglichen die Sammlung einer großen Vielzahl von Expressionsdaten für eine große Anzahl von Zellen, auch bei seltenen Populationen, da die Technik auf der klonalen Ebene durchgeführt wird. Dadurch werden kann ILC Heterogenität in der Leber ausreichend bewertet.
Als nächstes wird durch alle Zellen mit einem globalen ILC Phänotyp Sortierung, eine breite Übersicht über die Mehr Genexpression der Leber ILC Populationen erhalten wird, auch wenn sie extrem selten Populationen repräsentieren. Ein Mikrofluidik-basierten Chip ermöglicht das Experimentieren mit selbsteine geringe Menge an Zellmaterial. Als Folge können die Genexpressionsprofile von seltenen Zellpopulationen erhalten werden. Mit Online-Gen-Signatur-Analyse-Software, Zellpopulation Cluster und mögliche Zell Beziehungen untersucht werden. Folglich können Funktionstests durchgeführt werden , um die Cluster – Daten auf der in – vivo – Ebene zu überprüfen.
Zehn Genexpressionen werden könnten gleichzeitig auf Hunderte oder mehr einzelne Zellen auf dem gleichen Chip 3, 11, 12 bewertet. Design des Assays ist der längste und wichtigste Teil des Experiments. Die Bestimmung der Gene, die für die Hypothese getestet werden, ist von größter Bedeutung relevante Ergebnisse zu erhalten. Zweitens, die interne Kontrolle (wie bekannte Oberflächenmarker für das Sortieren verwendet) und spezifische Kontrollen erforderlich sind. Dies ist entscheidend, um die Primer-Amplifizierung Spezifität zu testen, die Effizienz der Amplifikation und ter ohne Primer Wettbewerb. Daher arbeitet mit Einzelzell Multiplex-RT-qPCR ist ein zeitsparendes Verfahren, das als Multiple-Genexpression einer Zelle zur gleichen Zeit beurteilt wird.
Mit dem gleichen Chip und Mischung von Reagenzien für alle Zellen begrenzt die möglichen Fehler der Manipulation und ermöglicht die Reproduzierbarkeit zwischen den Proben. Insgesamt lassen sich die verschiedenen Aspekte der Einzelzellen-Multiplex-RT-qPCR zur Herstellung von hochzuverlässige Ergebnisse auf der klonalen Ebene mit einem hohen Grad an Empfindlichkeit für eine Vielzahl von Proben und Genen. Die erzielten Ergebnisse bieten leistungsfähige und robuste Daten für biostatistischen Tests.
Dies kann aufgrund der mikrofluidischen Aspekt des Verfahrens erreicht werden, was auf sehr geringe Mengen an Material für die Arbeit ermöglicht und führt zu erschöpfende Ergebnisse. Schließlich Online-Software verwenden, ist es möglich, die gewünschten Populationen zu vergleichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie erschöpfend Genexpression Informationen auf der klonalen Ebene zu erhalten. Hier untersuchten wir ILC Kompartiment Heterogenität Leber. Nach einer Einzelzellsortierung verschiedener ILC Populationen (basierend auf weit ILC Oberflächenmarker ausgedrückt) wurden die Proben für bestimmte vorgewählte Gene vorverstärkt. Dann wurden die erhaltenen cDNA-Primer und geladen auf ein Multiplex-RT-qPCR mikrofluidischen Chip. Schließlich erhalten wir die Expression von 48 verschiedenen Genen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
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