Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek
Summary
Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir.
Abstract
Gen ifadesi heterojen lenfoid toplumlarda araştırmak için ilginç bir özelliktir. Bu hücrelerde gen ifadesi hücre aktivasyonu, stres veya uyarılması sırasında değişir. Tek hücreli çoklu gen sentezleme gen 1, 2, 3 onlarca aynı anda değerlendirilmesine olanak sağlar. Tek hücre düzeyinde, çoklu gen ekspresyonu popülasyon heterogenitesi 4, 5 belirler. Olgun hücreleri arasında farklı öncül aşamalarında olası karışımını ve aynı zamanda uyaranlara hücre yanıtlarının çeşitliliği hem de belirleyerek nüfus heterojenite ayrımı sağlar.
Doğuştan lenfoid hücreleri (LAK) en son bağışıklık tepkisi 6, 7 doğuştan efektörlerinin bir popülasyon olarak tarif edilmiştir. LAK kendisinden Bu protokolde, hücre heterojenlikhepatik bölme homeostazındaki sırasında incelenmiştir.
Şu anda, gen ekspresyonunu değerlendirmek için en yaygın olarak kullanılan bir teknik, RT-qPCR olup. Bu metot ölçümlerinin gen aynı anda yalnızca tek bir gen. birden çok hücre bir test için gerekli çünkü ek olarak, bu yöntem, gen ekspresyonunun heterojen tahmin edilemez. Bu popülasyonun ortalama gen ekspresyonunun ölçülmesi yol açar. gen çok sayıda değerlendirilirken, RT-qPCR bir zaman-, reagent- ve numune alıcı bir yöntemdir olur. Bu nedenle, ticaret-off küresel resim eksik riskini artıran değerlendirilebilir genler ya da hücre popülasyonlarının sayısını sınırlamak.
Bu yazının tek hücreli çoklu RT-qPCR bu sınırlamaları aşmak için nasıl kullanılabileceği anlatılmaktadır. Bu teknik son Mikroakiskan teknolojik gelişmeler 1, 2 yararlanmıştır. Multipleks RT-qPCR fiş meydana gelen reaksiyonlar tarifeler yoknanoliter düzeyi eed. Bu nedenle, tek bir hücre, gen ekspresyonu, hem de aynı anda birden fazla gen ekspresyonu, Örnek, bir reagent- uygulandı, ve maliyet-etkin bir şekilde olabilir. 5 farklı gelişim aşamalarında veya farklı koşullar altında 4 bir popülasyon içindeki hücre alt arasındaki klonal düzeyde hücre gen imza heterojenitesini test etmek mümkündür. tek hücre düzeyinde koşulları, çok sayıda nadir nüfus üzerinde çalışmak artık bir kısıtlamadır.
Introduction
Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, doğuştan lenfoid hücreler (Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar) giderek incelenmiştir. antijene spesifik reseptörlere karşı olmamasına rağmen, lenfoid soyuna aittir ve doku homeostazında ve iltihaplanma önemli sentineli temsil etmektedir. Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar şu transkripsiyon faktörü kombinasyonları kendi ifadesi ve sitokinler 6, 7 üretme yetenekleri göre üç gruba ayrılır.
Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar belirli sitokin üretimi 8, 9 vasıtasıyla çeşitli organlarda çok sayıda homeostatik ve patofizyolojik durumlara katkıda bulunur. Bu hücrelerin rolünü anlamak mümkün, organın başına çeşitli LAK alt popülasyonlar belirlemek ve bunların gelişim ilişkilerini belirlemek önemlidir. Buna ek olarak, farklı alt arasındaki plastisite olayları ile ilgili edilmiştir. heterojenitesini inceleyerekBir organın içinde mevcut hücre, bunlann olgunlaşma aşamasına sınırlandırmak için ve özel fonksiyonları ayırt etmek mümkündür.
Tek hücreli çoklu RT-qPCR tekniğini göstermek için, karaciğer Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar aynı LAK grupta (tip 1 LAK) 10 içinde kendi heterojenite özel bir vurgu ile, seçildi. İlk olarak, akış sitometrisi kullanılarak, üç farklı LAK popülasyonları karaciğerde karakterize edilmiştir. iki nüfus az hepatik LAK popülasyonları (doğuştan efektörlerinin% 5'ten az) ise Grup 1 ILC doğuştan efektör yaklaşık% 80'ini oluşturmaktadır. Bu popülasyonlar LAK nüfusun yaygın olarak dile hücre yüzey belirteçleri kullanılarak dizildi. Sonuç olarak, karaciğerde LAK popülasyonları başka büyük oranda benzer bir bakmak sınıflandırılmaktadır.
Tek hücreli çoklu RT-qPCR derhal bu popülasyonların 11 heterojenitesini araştırmak için en iyi tekniklerden biri olarak ortaya çıkmıştır </s> Yukarı. İki ana özellikleri tek hücreli çoklu RT-qPCR tekniğin yararlanan belirlenir. İlk olarak, klonal düzeyde bakarak, görünüşe göre benzer gelişim aşamalarını göstermek hücreler arasında karşılaştırma için hücre spesifik gen ifadesi kurtarmak mümkündür. Daha sonra, gen ekspresyonunun önceden seçilmiş bir kombinasyon bakarak, biz bir zaman noktasında eş zamanlı olarak gen ekspresyonu göre yeni gen imza belirleyecektir. tekniği klonal düzeyinde gerçekleştirilir, çünkü bu yönleri, daha az nüfus, hücrelerin geniş bir sayısı için sentezleme verilerinin bir çok çeşitli toplama izin verir. Böylece, karaciğer ILC heterojenite yeterli değerlendirilebilir.
Daha sonra, bir küresel ILC fenotipe sahip tüm hücreleri sıralayarak, karaciğer LAK popülasyonlarının çok gen ekspresyonu geniş bir genel son derece nadir popülasyonları temsil etse de, elde edilir. Bir Mikroakışkan tabanlı çip bile deney sağlarHücre maddesinin küçük bir miktar. Bunun bir sonucu olarak, nadir bir hücre popülasyonlarının gen ekspresyon profilleri elde edilebilir. Online gen imza analiz yazılımı, hücre popülasyonu kümeleri ve potansiyel hücre ilişkileri kullanılarak araştırılabilir. Sonuç olarak, fonksiyonel test in vivo düzeyde kümelenme verileri doğrulamak için gerçekleştirilebilir.
Genlerin onlarca aynı çip 3, 11, 12, yüzlerce ya da daha fazla tek hücreler üzerinde eş zamanlı olarak değerlendirilebilir. Deneyin tasarımı Deney en uzun ve en önemli parçasıdır. test edilecek hipoteze ilgili genlerin belirlenmesi, ilgili sonuçlar elde etmek için her şeyden önemlidir. İkincisi, ve özel kontroller (örneğin sıralama için kullanılan bilinen yüzey belirteçleri gibi) iç kontrol ihtiyaç vardır. Bu primer amplifikasyon özgüllük, amplifikasyon verimliliğini ve t test etmek çok önemlidirastar rekabet o yokluğu. Bir hücrenin birden çok gen ekspresyonu, aynı zamanda değerlendirilir Bu nedenle, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR ile çalışan bir zaman kazandıran bir tekniktir.
tüm hücreler için reaktiflerin aynı çip ve karışımı kullanılarak manipülasyon olası hataları sınırlar ve örnekler arasındaki tekrarlanabilirlik sağlar. Tamamen tek hücreli çoklu RT-qPCR farklı yönlerini örnekler ve genlerin çok çeşitli duyarlılık büyük bir seviyeye sahip, klonal düzeyde son derece güvenilir sonuçlar üretimine olanak sağlamaktadır. Elde edilen sonuçlar biyoistatistiksel testler için güçlü ve sağlam veri sunuyoruz.
Bunun nedeni, maddenin çok küçük miktarlarda çalışma sağlar ve ayrıntılı sonuçlara yol açar yöntemin mikroakışkan yönüne elde edilebilir. Son olarak, çevrimiçi yazılım kullanarak, istenilen popülasyonları karşılaştırmak mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol klonal düzeyde ayrıntılı gen ifadesi bilgilerini nasıl elde edileceği anlatılır. Burada, karaciğer LAK bölme heterojenite araştırdık. (Yaygın olarak dile LAK yüzey belirteçleri göre) farklı LAK popülasyonlarının tek hücreli sıralama sonra, numuneler belirli önceden seçilen genler için önceden çoğaltılmıştır. Daha sonra elde edilen cDNA'sı ve primerler A çoklu RT-qPCR mikroakışkan çip üzerine yüklendi. Son olarak, 48 tek hücre 48 farklı gen ekspresyonunu elde etti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue – inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells – a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a., Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
