レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現
Summary
このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。
Abstract
遺伝子発現の不均一性は、リンパ集団で調査する興味深い特徴です。これらの細胞における遺伝子発現は、細胞活性化、ストレス、又は刺激中に変化します。単一セルマルチプレックス遺伝子発現は遺伝子1、2、3の数十の同時評価を可能にします。単一細胞レベルでは、多重遺伝子発現は、集団の不均一4,5判定する。これは、成熟した細胞間の多様な前駆段階の可能性ミックスとも刺激に対する細胞応答の多様性の両方を決定することにより、人口の異質性の区別を可能にします。
先天性リンパ系細胞（ILC）は最近、免疫応答6、7の生来のエフェクターの集団として記載されています。 ILC彼のこのプロトコルでは、細胞の不均一paticコンパートメントは恒常性の間に検討されています。
現在、遺伝子発現を評価するための最も広く使用される技術は、RT-qPCRのです。この方法は、一度に遺伝子発現1つの遺伝子のみを測定します。複数のセルを1つのテストのために必要とされるのでさらに、この方法は、遺伝子発現の不均一性を推定することができません。これは、集団の平均遺伝子発現の測定をもたらします。多数の遺伝子を評価する場合、RT-qPCRのは、時間、reagent-、およびサンプルのかかる方法になります。したがって、トレードオフがグローバル画像を欠落するリスクを増大させる、評価することができる遺伝子または細胞集団の数を制限します。
この原稿は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRには、これらの制限を克服するために使用することができる方法を記載しています。この技術は、最近のマイクロフルイディクス技術の進歩1、2から恩恵を受けています。マルチプレックスRT-qPCRをチップに起こる反応はEXCありませんナノリットルレベルをEED。したがって、単一細胞遺伝子発現、ならびに同時に複数の遺伝子の発現、reagent-、試料 – 、および費用対効果の高い方法で行うことができます。異なる発達段階で、または異なる条件4,5の下で集団内の細胞のサブセット間クローンレベルでの細胞遺伝子シグネチャーの不均一性をテストすることができます。単一細胞レベルでの条件の数が多い希少な集団での作業はもはや制限ではありません。
Introduction
過去数年間、先天性リンパ系細胞（ILCS）は、ますます研究されてきました。抗原特異的受容体の欠如にもかかわらず、彼らはリンパ系統に属し、組織の恒常性や炎症のための重要な番兵を表します。 ILCSは、現在、特定の転写因子の組合せの発現におよびサイトカイン6,7を産生する能力に基づいて3つのグループに分けています。
ILCSは、特定のサイトカイン産生8、9を介して多様な器官における数多くの恒常性および病態生理学的状況に貢献しています。これらの細胞の役割を理解することができるためには、臓器ごとに様々なILC亜集団を決定し、それらの発達の関係を識別することが重要です。また、異なるサブセット間の可塑性の現象が関連しています。異質性を研究することによって1つの器官に存在する細胞では、成熟のその段階を区切るために、それらの特定の機能を区別することが可能です。
単一セルの多重RT-qPCRの技術を説明するために、肝ILCSは同じILCグループ（タイプ1 ILC）10内に、その異質性に特に重点を置いて、選択されました。まず、フローサイトメトリーを使用することによって、三つの異なるILC集団は、肝臓中で特徴づけました。他の二つの集団が、稀な肝ILC集団（先天性エフェクターの5％未満）でありながら、グループ1 ILCは、生来のエフェクターの約80％を占めています。これらの集団は、ILC集団の広く発現される細胞表面マーカーを用いて選別しました。その結果、肝臓におけるILC集団が別に広く同様のものを見て選別しました。
シングルセル多重RT-qPCRを速やかにこれらの集団11の不均一性を調査するための最良の手法の一つとして浮上しています</s>アップ。二つの主な特徴は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの技術を利用して決定されます。まず、クローンレベルを見て、明らかに類似した発達段階を示す細胞との比較のために、細胞特異的遺伝子発現を回復することが可能です。そして、遺伝子発現の予め選択された組み合わせを見ることによって、我々は、1つの時点での同時の遺伝子発現パターンに基づいて、新たな遺伝子特性を決定します。技術は、クローンレベルで行われるので、これらの態様は、さらに稀な集団に、多数の細胞のための発現データの多様な収集を可能にします。これにより、肝臓におけるILC異質性が適切に評価することができます。
次に、グローバルILC表現型を有するすべての細胞を選別することにより、肝臓ILC集団の複数の遺伝子の発現の広範な概要は、それらが非常にまれな集団を表していても、得られます。マイクロ流体ベースのチップもで実験を可能にします細胞物質の少量。その結果、希少細胞集団の遺伝子発現プロファイルを得ることができます。オンライン遺伝子特性分析ソフトウェアを用いて、細胞集団のクラスタと電位セルとの関係を調べることができます。これにより、機能テストは、in vivoレベルでクラスタリングデータを検証するために行うことができます。
遺伝子発現の十同じチップ3、11、12の数百以上の単一の細胞に同時に評価することができます。アッセイの設計は、実験の最長かつ最も重要な部分です。試験されるべき仮説に関連する遺伝子の決意は、適切な結果を得るために最も重要です。 （そのようなソートに使用される公知の表面マーカーなど）第二に、内部統制および特定のコントロールが必要とされています。これは、プライマー増幅特異性、増幅効率、およびtをテストすることが重要ですプライマー競争の彼が不在。セルの複数の遺伝子発現を同時に評価されるようにそのため、単一セル多重RT-qPCRをでの作業は、時間節約テクニックです。
すべてのセルのための試薬の同じチップとミックスを使用すると、操作のエラーの可能性を制限し、サンプル間の再現を可能にします。要するに、単一セル多重RT-qPCRをのさまざまな側面は、サンプルや遺伝子の幅広い感度の偉大なレベルで、クローンレベルでの信頼性の高い結果の生成を可能にします。得られた結果は、生物統計学的試験のための強力かつ堅牢なデータを提供しています。
これは、材料の非常に少量の作業を可能にし、徹底的な結果をもたらす方法のマイクロ流体態様に達成することができます。最後に、オンラインソフトウェアを使用して、所望の集団を比較することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、クローンレベルでの網羅的な遺伝子発現情報を取得する方法について説明します。ここでは、肝臓ILCコンパートメントの不均一性を調べました。 （広く発現ILC表面マーカーに基づいて）異なるILC集団の単一細胞選別後、サンプルを特定の予め選択された遺伝子のための予備増幅しました。次に、得られたcDNAおよびプライマーは、多重RT-qPCRをマイクロ流体チップにロード?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue – inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells – a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a., Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
