Single-celle genekspression Brug Multiplex RT-qPCR at Karakterisere Meget forskellige sjældne Lymfoide populationer
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man vurdere ekspression af et stort array af gener på den klonale niveau. Single-celle RT-qPCR producerer meget pålidelige resultater med en stærk følsomhed for hundreder af prøver og gener.
Abstract
Genekspression heterogenitet er en interessant funktion til at undersøge i lymfoide populationer. Genekspression i disse celler varierer under celleaktivering, stress eller stimulation. Encellede multiplex genekspression muliggør samtidig vurdering af snesevis af gener 1, 2, 3. På det encellede niveau, multiplex genekspression bestemmer befolkning heterogenitet 4, 5. Det giver mulighed for sondringen af befolkningen heterogenitet ved at bestemme både den sandsynlige mix af forskellige prækursorer stadier blandt modne celler og også de mange forskellige celle responser på stimuli.
Medfødte lymfoide celler (ILC) er for nylig blevet beskrevet som en population af medfødte effektorer af immunresponset 6, 7. I denne protokol, celle heterogenitet ILC hanpatic rum er undersøgt i homøostase.
I øjeblikket er den mest anvendte teknik til at vurdere genekspression er RT-qPCR. Denne metode foranstaltninger genekspression kun ét gen ad gangen. Derudover kan denne metode ikke estimere heterogenitet af genekspression, da der er behov for flere celler til én test. Dette fører til målingen af den gennemsnitlige genekspression af befolkningen. Ved vurdering stort antal gener, RT-qPCR bliver en tids-, reagent-, og prøve-forbrugende metode. Derfor afvejninger begrænse antallet af gener eller cellepopulationer, der kan evalueres, hvilket øger risikoen for manglende det globale billede.
Dette håndskrift beskriver, hvordan encellede multipleks RT-qPCR kan anvendes til at overvinde disse begrænsninger. Denne teknik har nydt godt af de seneste mikrostrømning teknologiske fremskridt 1, 2. Reaktioner, der opstår i multiplex RT-qPCR chips ikke excBehov for nanoliter-niveau. Derfor encellede genekspression, såvel som samtidig multipel genekspression, kan udføres i en reagent-, prøvetagningsmo og omkostningseffektiv måde. Det er muligt at teste celle gen signatur heterogenitet på den klonale niveau mellem celledelmængder i en population på forskellige udviklingsstadier eller under forskellige betingelser 4, 5. Arbejde på sjældne populationer med et stort antal forholdene på enkeltcelle-niveau ikke længere en begrænsning.
Introduction
I løbet af de sidste par år, har medfødte lymfoide celler (ILCs) i stigende grad blevet undersøgt. På trods af deres manglende antigen-specifikke receptorer, de tilhører den lymfoide afstamning og udgør vigtige Skildvagter for vævshomeostase og inflammation. ILCs øjeblikket opdelt i tre grupper baseret på deres ekspression af transkriptionsfaktor kombinationer og deres evne til at producere cytokiner 6, 7.
ILCs bidrager til en lang række homeostatiske og patofysiologiske situationer i forskellige organer via specifik cytokinproduktion 8, 9. For at kunne forstå betydningen af disse celler, er det vigtigt at bestemme de forskellige ILC subpopulationer pr orgel og at identificere deres udviklingsmæssige forhold. Derudover har fænomener af plasticitet mellem de forskellige undersæt været relateret. Ved at studere heterogenitetaf cellerne til stede i et organ, er det muligt at afgrænse deres stadium af modning og til at skelne deres specifikke funktioner.
For at illustrere teknikken med single-celle multipleks RT-qPCR blev hepatiske ILCs udvalgt, med særlig vægt på deres heterogenitet inden for samme ILC gruppe (type 1 ILC) 10. Først ved anvendelse af flowcytometri, blev tre distinkte ILC populationer kendetegnet i leveren. Gruppe 1 ILC udgør ca. 80% af de medfødte effektorer, mens de to andre populationer er sjældne hepatiske ILC populationer (mindre end 5% af de medfødte effektorer). Disse populationer blev sorteret ved hjælp bredt udtrykte celle-overflade markører for ILC befolkninger. Som et resultat, sorteret ILC populationer i leveren ser stort set ens ene til den anden.
Single-celle multipleks RT-qPCR har vist sig som en af de bedste teknikker til straks at undersøge heterogenitet disse populationer 11 </sop>. To vigtige egenskaber bestemmes ved at drage fordel af en enkelt celle multipleks RT-qPCR teknik. Først ved at kigge på den klonale niveau, er det muligt at genvinde cellespecifik genekspression til sammenligning mellem celler, der tilsyneladende udviser lignende udviklingsstadier. Derefter, ved at se på en forud valgt kombination af genekspression, vil vi bestemme nye gen signaturer baseret på samtidige genekspressionsmønstre på én gang punkt. Disse aspekter tillader samling af en lang række ekspressionssystemer data for et stort antal celler, selv om sjældne populationer, eftersom teknikken udføres ved den klonale niveau. Derved kan ILC heterogenitet i leveren være tilstrækkeligt vurderet.
Dernæst ved at sortere alle celler med en global ILC fænotype, er en bred oversigt over den multiple-genekspression af leveren ILC befolkninger opnået, selvom de repræsenterer ekstremt sjældne befolkninger. Mikrofluidapparat-baserede chip muliggør eksperimenter med endnuen lille mængde cellemateriale. Som følge heraf kan der opnås genekspressionsprofilerne af sjældne cellepopulationer. Brug online gen signatur analyse software, celle population klynger og potentielle celle relationer kan undersøges. Derfor kan funktionelle tests udføres for at validere clustering data på in vivo-niveau.
Snesevis af genekspressioner kunne vurderes samtidig på flere hundrede eller flere enkelte celler på den samme chip 3, 11, 12. Design af assayet er den længste og vigtigste del af eksperimentet. Bestemmelsen af de gener, der er relevante for den hypotese der skal testes er altafgørende for at opnå relevante resultater. For det andet er der behov for intern kontrol (såsom kendte overflademarkører anvendes til sortering) og specifik kontrol. Dette er afgørende for at teste primeramplifikation specificitet, effektivitet amplifikationen, og than fravær af primer konkurrence. Derfor arbejder med encellede multipleks RT-qPCR er en tidsbesparende teknik, som multiple-genekspression af en celle vurderes samtidig.
Brug den samme chip og blanding af reagenser til alle celler begrænser de mulige fejl manipulation og giver mulighed for reproducerbarhed mellem prøverne. Helt, de forskellige aspekter af encellede multipleks RT-qPCR muliggør fremstillingen af højt pålidelige resultater på den klonale niveau, med en stor grad af følsomhed for en bred vifte af prøver og gener. De opnåede resultater giver kraftfulde og robuste data for biostatistiske tests.
Dette kan opnås på grund af den mikrofluid aspekt af fremgangsmåden, som giver mulighed for arbejde på meget små mængder af materiale og fører til udtømmende resultater. Endelig hjælp af online software, er det muligt at sammenligne de ønskede populationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man få udtømmende genekspression information på klonale niveau. Her undersøgte vi lever ILC rum heterogenitet. Efter encellede sortering af forskellige ILC populationer (baseret på bredt udtrykte ILC overflademarkører) blev prøver præ-forstærket til specifikke forhåndsudvalgte gener. Derefter blev den opnåede cDNA og primere påsat en multipleks RT-qPCR mikrofluid chip. Endelig opnåede vi ekspressionen af 48 forskellige gener fra 48 enkeltceller. Genekspression resulta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue – inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells – a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a., Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
