Unicellulaire Gene Expression utilisant Multiplex RT-qPCR à Caractériser Hétérogénéité des rares populations lymphoïdes

Thibaut Perchet; Sylvestre Chea; Milena Hasan; Ana Cumano; Rachel Golub

doi:10.3791/54858

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Article de méthode

Unicellulaire Gene Expression utilisant Multiplex RT-qPCR à Caractériser Hétérogénéité des rares populations lymphoïdes

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DOI :

10.3791/54858

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19 janvier 2017

Thibaut Perchet¹ , Sylvestre Chea¹ , Milena Hasan² , Ana Cumano¹ , Rachel Golub¹

¹Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, ²Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit comment évaluer l'expression d'un large éventail de gènes au niveau clonal. Unicellulaire RT-qPCR produit des résultats très fiables avec une forte sensibilité pour des centaines d'échantillons et les gènes.

Résumé

L'expression des gènes hétérogénéité est une caractéristique intéressante pour enquêter dans les populations lymphoïdes. L'expression des gènes dans ces cellules varie au cours de l'activation cellulaire, le stress, ou la stimulation. L' expression du gène de multiplexage unicellulaire permet l'évaluation simultanée de plusieurs dizaines de gènes ^{^1,} ^{^2,} ^3. Au niveau d'une seule cellule, l' expression des gènes multiplex détermine la population hétérogénéité ^{^4,} ^5. Il permet la distinction de l'hétérogénéité de la population en déterminant à la fois le mélange probable de stades précurseurs diverses entre les cellules matures et aussi la diversité des réponses cellulaires à des stimuli.

Cellules lymphoïdes innées (CIT) ont récemment été décrit comme une population de effecteurs innées de la réponse immunitaire ^{^6,} ^7. Dans ce protocole, l'hétérogénéité des cellules de la CIT, ilcompartiment Patic est étudiée au cours de l'homéostasie.

Actuellement, la technique la plus largement utilisée pour évaluer l'expression du gène est RT-qPCR. Cette expression génétique méthode mesure seul gène à la fois. En outre, cette méthode ne permet pas d'estimer l'hétérogénéité de l'expression génique, étant donné que plusieurs cellules sont nécessaires pour un test. Cela conduit à la mesure de l'expression du gène moyen de la population. Lors de l'évaluation grand nombre de gènes, RT-qPCR devient une durée de vie, et la méthode d'échantillonnage consommant reagent-. Par conséquent, les compromis limitent le nombre de gènes ou de populations de cellules qui peuvent être évalués, ce qui augmente le risque de manquer l'image globale.

Ce mémoire décrit multiplex unicellulaire par RT-PCR quantitative peut être utilisée pour surmonter ces limitations. Cette technique a bénéficié de récentes avancées technologiques microfluidique ^{^1,} ^2. Les réactions qui se produisent dans les puces multiplex RT-qPCR ne sont pas excEED niveau-nanolitre. Par conséquent, l'expression des gènes de cellules isolées, ainsi que l'expression des gènes multiples simultanées peuvent être effectuées dans un reagent-, échantillon-, et d'une manière rentable. Il est possible de tester le gène cellulaire signature hétérogénéité au niveau clonal entre les sous - ensembles de cellules dans une population à différents stades de développement ou dans des conditions différentes de ^{^4,} ^5. Travailler sur les populations rares avec un grand nombre de conditions au niveau d'une seule cellule est plus une restriction.

Introduction

Au cours des dernières années, les cellules lymphoïdes innées (de ILC) ont été de plus en plus étudié. En dépit de leur manque de récepteurs spécifiques d'un antigène, ils appartiennent à la lignée lymphoïde et représentent des sentinelles importantes pour l'homéostasie tissulaire et une inflammation. CVA sont actuellement classés en trois groupes en fonction de leur expression de combinaisons spécifiques de facteurs de transcription ainsi que sur leur capacité à produire des cytokines ^{^6,} ^7.

ILC contribuent à de nombreuses situations homéostatiques et physiopathologiques d....