Unicellulaire Gene Expression utilisant Multiplex RT-qPCR à Caractériser Hétérogénéité des rares populations lymphoïdes
Summary
Ce protocole décrit comment évaluer l'expression d'un large éventail de gènes au niveau clonal. Unicellulaire RT-qPCR produit des résultats très fiables avec une forte sensibilité pour des centaines d'échantillons et les gènes.
Abstract
L'expression des gènes hétérogénéité est une caractéristique intéressante pour enquêter dans les populations lymphoïdes. L'expression des gènes dans ces cellules varie au cours de l'activation cellulaire, le stress, ou la stimulation. L' expression du gène de multiplexage unicellulaire permet l'évaluation simultanée de plusieurs dizaines de gènes 1, 2, 3. Au niveau d'une seule cellule, l' expression des gènes multiplex détermine la population hétérogénéité 4, 5. Il permet la distinction de l'hétérogénéité de la population en déterminant à la fois le mélange probable de stades précurseurs diverses entre les cellules matures et aussi la diversité des réponses cellulaires à des stimuli.
Cellules lymphoïdes innées (CIT) ont récemment été décrit comme une population de effecteurs innées de la réponse immunitaire 6, 7. Dans ce protocole, l'hétérogénéité des cellules de la CIT, ilcompartiment Patic est étudiée au cours de l'homéostasie.
Actuellement, la technique la plus largement utilisée pour évaluer l'expression du gène est RT-qPCR. Cette expression génétique méthode mesure seul gène à la fois. En outre, cette méthode ne permet pas d'estimer l'hétérogénéité de l'expression génique, étant donné que plusieurs cellules sont nécessaires pour un test. Cela conduit à la mesure de l'expression du gène moyen de la population. Lors de l'évaluation grand nombre de gènes, RT-qPCR devient une durée de vie, et la méthode d'échantillonnage consommant reagent-. Par conséquent, les compromis limitent le nombre de gènes ou de populations de cellules qui peuvent être évalués, ce qui augmente le risque de manquer l'image globale.
Ce mémoire décrit multiplex unicellulaire par RT-PCR quantitative peut être utilisée pour surmonter ces limitations. Cette technique a bénéficié de récentes avancées technologiques microfluidique 1, 2. Les réactions qui se produisent dans les puces multiplex RT-qPCR ne sont pas excEED niveau-nanolitre. Par conséquent, l'expression des gènes de cellules isolées, ainsi que l'expression des gènes multiples simultanées peuvent être effectuées dans un reagent-, échantillon-, et d'une manière rentable. Il est possible de tester le gène cellulaire signature hétérogénéité au niveau clonal entre les sous – ensembles de cellules dans une population à différents stades de développement ou dans des conditions différentes de 4, 5. Travailler sur les populations rares avec un grand nombre de conditions au niveau d'une seule cellule est plus une restriction.
Introduction
Au cours des dernières années, les cellules lymphoïdes innées (de ILC) ont été de plus en plus étudié. En dépit de leur manque de récepteurs spécifiques d'un antigène, ils appartiennent à la lignée lymphoïde et représentent des sentinelles importantes pour l'homéostasie tissulaire et une inflammation. CVA sont actuellement classés en trois groupes en fonction de leur expression de combinaisons spécifiques de facteurs de transcription ainsi que sur leur capacité à produire des cytokines 6, 7.
ILC contribuent à de nombreuses situations homéostatiques et physiopathologiques dans divers organes via la production de cytokines spécifiques 8, 9. Pour être en mesure de comprendre le rôle de ces cellules, il est important de déterminer les différentes sous-populations de la CDI par organe et d'identifier leurs relations de développement. En outre, des phénomènes de plasticité entre les différents sous-ensembles ont été liés. En étudiant l'hétérogénéitédes cellules présentes dans un organe, il est possible de délimiter leur stade de maturation et de distinguer leurs fonctions spécifiques.
Pour illustrer la technique de multiplexage à cellule unique RT-qPCR, ILC hépatiques ont été choisis, avec un accent particulier sur leur hétérogénéité au sein du même groupe CIT (type 1 ILC) 10. Tout d'abord, grâce à l'utilisation de la cytométrie de flux, trois populations distinctes de la CDI ont été caractérisées dans le foie. Groupe 1 CIT représente environ 80% des effecteurs innés, tandis que les deux autres populations sont les populations ILC hépatiques rares (moins de 5% des effecteurs innés). Ces populations ont été triés à l'aide largement exprimées marqueurs de surface cellulaire des populations ILC. En conséquence, les populations triées ILC dans le foie semblent largement semblables l'un à l'autre.
Multiplex unique cellule RT-qPCR a émergé comme l' une des meilleures techniques pour enquêter rapidement sur l'hétérogénéité de ces populations 11 </sup>. Deux caractéristiques sont déterminées en prenant avantage du multiplex unicellulaire technique de RT-PCR quantitative. Tout d'abord, en regardant au niveau clonal, il est possible de récupérer l'expression génique spécifique d'une cellule pour une comparaison entre les cellules qui présentent apparemment des stades de développement similaires. Puis, en regardant une combinaison pré-sélectionnée de l'expression des gènes, nous allons déterminer de nouvelles signatures de gènes basée sur les profils d'expression génique simultanées à un point de temps. Ces éléments permettent la collecte d'une grande variété de données d'expression d'un grand nombre de cellules, même sur des populations rares, car la technique est réalisée au niveau clonal. Ainsi, l'hétérogénéité ILC dans le foie peut être évaluée de manière adéquate.
Ensuite, en triant toutes les cellules avec un phénotype ILC global, un large aperçu de l'expression multiple gène du foie populations ILC est obtenue, même si elles représentent des populations extrêmement rares. Une puce à base de microfluidique permet l'expérimentation de mêmeune petite quantité de matériau cellulaire. En conséquence, les profils d'expression génétique des populations de cellules rares peuvent être obtenus. Grâce à un logiciel en ligne de signature génétique d'analyse, les grappes de la population cellulaire et les relations cellulaires potentiels peut être étudiée. Par conséquent, les tests fonctionnels peuvent être effectués pour valider les données de classification au niveau in vivo.
Des dizaines d'expressions de gènes pourraient être évalués de manière concomitante sur des centaines ou des cellules plus simples sur la même puce 3, 11, 12. Conception de l'essai est la partie la plus longue et la plus importante de l'expérience. La détermination des gènes pertinents à l'hypothèse à tester est essentielle pour obtenir des résultats pertinents. Deuxièmement, le contrôle interne (tels que des marqueurs de surface connus utilisés pour le tri) et des contrôles spécifiques sont nécessaires. Ceci est crucial pour tester la spécificité amorce d'amplification, l'efficacité de l'amplification, et til absence de concurrence de l'amorce. Par conséquent, en travaillant avec une seule cellule multiplex RT-PCR quantitative est une technique qui fait gagner du temps, car l'expression de multiples gènes d'une cellule est évaluée en même temps.
En utilisant la même puce et la combinaison de réactifs pour toutes les cellules limite les éventuelles erreurs de manipulation et permet la reproductibilité entre les échantillons. Au total, les différents aspects de multiplex à cellule unique RT-qPCR permet la production de résultats très fiables au niveau clonal, avec un grand niveau de sensibilité pour une grande variété d'échantillons et de gènes. Les résultats obtenus offrent des données puissants et robustes pour les tests biostatistiques.
Ceci peut être réalisé en raison de l'aspect microfluidique du procédé, ce qui permet de travailler sur de très petites quantités de matériau et conduit à des résultats exhaustifs. Enfin, en utilisant un logiciel en ligne, il est possible de comparer les populations désirées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit comment obtenir des informations d'expression génique exhaustive au niveau clonal. Ici, nous avons étudié le foie ILC compartiment hétérogénéité. Après un tri à cellule unique des différentes populations de la CIT (basées sur des marqueurs de surface ILC largement exprimés), les échantillons ont été pré-amplifiées pour les gènes présélectionnés spécifiques. Ensuite, l'ADNc obtenu et des amorces ont été chargées sur une RT-qPCR puce microfluidique multiplex. Enfin, n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue – inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells – a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a., Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
