मापने नाइट्राइट और नाइट्रेट, मेटाबोलाइट्स नाइट्रिक ऑक्साइड मार्ग में, जैविक सामग्री में Chemiluminescence विधि का उपयोग
Summary
Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.
Abstract
नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) संवहनी homeostasis और यह भी एक न्यूरोट्रांसमीटर में मुख्य नियामक अणुओं में से एक है। Enzymatically उत्पादित सं विभिन्न ऑक्सी हीम प्रोटीन और अन्य अभी भी अच्छी तरह से नहीं जाना जाता रास्ते के साथ बातचीत के द्वारा नाइट्राइट और नाइट्रेट में ऑक्सीकरण हो जाता है। रिवर्स प्रक्रिया, सं में नाइट्राइट और नाइट्रेट की कमी पिछले एक दशक में स्तनधारियों में खोज की गई थी और यह संभव रास्ते या तो रोकने या हृदय, चयापचय और मांसपेशियों में विकारों की एक पूरी श्रृंखला है कि माना जाता है कम करने के लिए एक के रूप में ध्यान प्राप्त कर रहा है सं के कम स्तर के साथ जुड़ा हो। खून, शरीर के तरल पदार्थ और विभिन्न ऊतकों – यह शरीर के विभिन्न डिब्बों में कोई और इसकी चयापचयों की राशि का अनुमान करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। रक्त, इसकी आसान पहुंच के कारण, सं चयापचयों के आकलन के लिए इस्तेमाल को प्राथमिकता दी कम्पार्टमेंट है। अपने छोटे जीवनकाल (कुछ मिसे) और कम उप nanomolar एकाग्रता, कोई खून का सीधा विश्वसनीय माप के कारण <उन्हें> विवो उपस्थित महान तकनीकी कठिनाइयों में। इस तरह कोई उपलब्धता आमतौर पर इसकी ऑक्सीकरण उत्पादों, नाइट्राइट और नाइट्रेट की मात्रा पर आधारित अनुमान है। इन दो चयापचयों हमेशा अलग से मापा जाता है। वहाँ कई अच्छी तरह से स्थापित तरीकों जैविक तरल पदार्थ और ऊतकों में उनकी सांद्रता निर्धारित करने के लिए कर रहे हैं। यहाँ हम chemiluminescence विधि (सीएल) के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, सप्ताह में तीन आयोडाइड या वैनेडियम (तृतीय) क्लोराइड समाधान क्रमश नाइट्राइट या नाइट्रेट कमी के बाद कोई spectrophotometrical का पता लगाने पर आधारित है। नाइट्राइट और नाइट्रेट का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता कम nanomolar रेंज है, जो सबसे ज्यादा संवेदनशील विधि कोई चयापचय मार्ग में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध के रूप में सीएल सेट में है। हम कैसे आदेश संग्रह और कैसे के समय के नमूनों में उनके संबंधित मात्रा निर्धारित करने के लिए कम से नाइट्राइट और नाइट्रेट वर्तमान की मूल राशि को बनाए रखने के लिए जैविक तरल पदार्थ और ऊतकों से नमूने तैयार करने के लिए विस्तार से समझाओ। सीएल तकनीक की सीमाएं भी विस्तार कर रहे हैंlained।
Introduction
नाइट्राइट, और एक कम का विस्तार करने के लिए नाइट्रेट, रक्त में स्तर को प्रतिबिंबित शरीर के समग्र राज्य का कोई चयापचय। रक्त में नाइट्राइट सांद्रता और सबसे अंगों और ऊतकों हैं केवल उच्च nanomolar या कम micromolar रेंज में, नाइट्रेट आमतौर पर बहुत अधिक मात्रा में मौजूद है – micromolar रेंज में। या आहार आदतों में परिवर्तन रोग प्रगति के कारण नाइट्राइट के स्तर में परिवर्तन काफी छोटे हैं और केवल एक बहुत ही संवेदनशील पद्धति का उपयोग करके मापा जा सकता है। क्योंकि उनके बहुत विभिन्न स्तरों और विभिन्न चयापचय की प्रक्रिया को, नाइट्राइट और नाइट्रेट के स्तर के अलग दृढ़ संकल्प जरूरी है। तथाकथित "नहीं x दृढ़ संकल्प" जहां नाइट्राइट और नाइट्रेट एक साथ मापा जाता है बहुत कम मूल्य है।
विभिन्न जैविक नमूने में नाइट्राइट बढ़ाता के लिए कई तरीकों का विकास किया गया है – सबसे आम प्राचीनतम जा रही है, Griess प्रतिक्रिया है कि मूल रूप से यहां तक कि आधुनिक modificatio के साथ 1879 में वर्णित किया गया था पर आधारितएनएस, Griess 'विधि द्वारा प्राप्य नाइट्राइट के लिए संवेदनशीलता सीमा कम micromolar रेंज में है। Chemiluminescence (सीएल), सप्ताह में तीन आयोडाइड समाधान को कम करने के साथ संयुक्त, वर्तमान में सबसे संवेदनशील तरीका माना जाता है, नाइट्राइट सांद्रता 1-8,10,11 की कम nanomolar रेंज में मात्रा का ठहराव की इजाजत दी। एक ही सीएल विधि, वैनेडियम (तृतीय) क्लोराइड समाधान को कम करने के साथ संयुक्त, नाइट्रेट के संवेदनशील मापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, nanomolar रेंज 9 में परिशुद्धता के साथ।
सीएल मुक्त गैस कोई पता लगाता है। इसलिए, नाइट्राइट, नाइट्रेट, आर nitrosothiols (आर-SNO), आर nitrosoamines (आर-NNO), या धातु-नो यौगिकों (बाद में पांडुलिपि के रूप में भेजा "आर (एक्स) -नहीं"), में परिवर्तित किया जाना चाहिए आदेश सीएल के माध्यम से उनके मूल मात्रा यों में कोई गैस मुक्त। नहीं करने के लिए कई अलग अलग रूपांतरण को कम करने के समाधान का उपयोग कर हासिल की है, नहीं मेटाबोलाइट की प्रकृति पर निर्भर करता है। रूपांतरण के बाद, मुक्त कोई गैस एक वाहक गैस (वह, एन द्वारा प्रतिक्रिया पोत से पर्ज है2 या आर) सीएल विश्लेषक की प्रतिक्रिया कक्ष जहां ओजोन (ओ 3) कोई साथ संयुक्त है नाइट्रोजन डाइऑक्साइड के लिए फार्म में (सं 2) अपनी सक्रिय राज्य में। जमीन राज्य में लौटने के साथ, कोई 2 * अवरक्त क्षेत्र में उत्सर्जन करता है और उत्सर्जित फोटोन photomultiplier सीएल साधन की (पीएमटी) द्वारा पता चला है। उत्सर्जित प्रकाश की तीव्रता सीधे प्रतिक्रिया कक्ष में कोई एकाग्रता, जो उचित अंशांकन घटता का उपयोग मूल प्रजातियों की एकाग्रता की गणना के लिए अनुमति देता है के लिए आनुपातिक है।
हमारे प्रोटोकॉल में, हम सबसे अधिक इस्तेमाल किया नैदानिक सेटिंग में नाइट्राइट और नाइट्रेट की पहली उपस्थित CL-आधारित दृढ़ संकल्प – रक्त और प्लाज्मा में, और फिर हम कैसे ऊतकों के नमूनों में इन आयनों निर्धारित करने के लिए चर्चा की। हम यह भी कि कैसे इस तरह के खून और उसके डिब्बों, प्लाज्मा और लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में नाइट्राइट प्रतिक्रियाशील वातावरण में मूल शारीरिक नाइट्राइट एकाग्रता संरक्षित करने के लिए विस्तार से समझाओ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
(पानी सहित) सभी समाधान, तैयार पतला या अन्यथा के इलाज के लिए इस्तेमाल किया मूल नमूने की aliquots को बचाया जा सकता है और संभव नाइट्राइट या (अधिक बार) नाइट्रेट प्रदूषण क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक रक्त में नाइट्राइट मापन के लिए नाइट्राइट संरक्षण समाधान के उपयोग के विकास में डॉ ए Dejam और एम.एम. पेलेटियर के महत्वपूर्ण योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
References
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
- Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
- Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E., Hancock, J. T. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. 476, 11-28 (2008).
- Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
- Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
- Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
- Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
- Smárason, A. K. 1., Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).
- Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
- Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
