Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza
Summary
Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.
Abstract
L'ossido nitrico (NO) è una delle principali molecole regolatore dell'omeostasi vascolare e anche un neurotrasmettitore. Enzimatica prodotta NO viene ossidato in nitriti e nitrati dalle interazioni con diverse proteine ossi-eme e altri percorsi ancora poco conosciuti. Il processo inverso, la riduzione dei nitriti e nitrati in NO era stato scoperto nei mammiferi negli ultimi dieci anni ed è guadagnando attenzione come uno dei possibili percorsi per sia prevenire o alleviare una vasta gamma di malattie cardiovascolari, malattie metaboliche e muscolari che si pensa essere associato con diminuzione dei livelli di NO. È quindi importante valutare la quantità di NO e suoi metaboliti in differenti compartimenti corporei – sangue, fluidi corporei e vari tessuti. Sangue, grazie alla sua facile accessibilità, è il vano preferito utilizzato per la stima dei metaboliti. A causa della sua breve vita (pochi millisecondi) e bassa concentrazione di sub-nanomolari, misurazioni affidabili dirette di sangue NO <em> in vivo presentano grandi difficoltà tecniche. Così NO disponibilità è solitamente stimato in base alla quantità dei suoi prodotti di ossidazione, nitriti e nitrati. Questi due metaboliti vengono sempre misurati separatamente. Ci sono diversi metodi ben stabiliti per determinare le loro concentrazioni nei fluidi e nei tessuti biologici. Qui vi presentiamo un protocollo per il metodo chemiluminescenza (CL), in base alla rilevazione spettrofotometrica di NO dopo nitriti o nitrati riduzione di (III) soluzioni di cloruro rispettivamente tri-ioduro o vanadio,. La sensibilità per nitriti e nitrati rilevamento è in gamma bassa nanomolari, che stabilisce CL come il metodo più sensibile attualmente disponibile per determinare le variazioni di NO vie metaboliche. Vi spieghiamo in dettaglio come preparare campioni di fluidi e tessuti biologici al fine di preservare quantità originali di nitriti e nitrati presenti al momento della raccolta e su come determinare le loro rispettive quantità nei campioni. Limitazioni della tecnica CL sono anche explained.
Introduction
Nitrito, e ad un nitrato meno estendere, i livelli nel sangue riflettono stato generale del corpo NO metabolismo. concentrazione dei nitriti nel sangue e la maggior parte degli organi e tessuti sono solo in alta nanomolari o gamma micromolare basso, il nitrato di solito è presente in quantità molto più elevate – nella gamma micromolare. I cambiamenti nei livelli di nitriti a causa di progressione della malattia o cambiamenti nelle abitudini alimentari sono piuttosto piccole e possono essere misurati solo con un metodo molto sensibile. A causa delle loro molto diversi livelli e diversi processi metabolici, la determinazione separata dei livelli di nitriti e nitrati è essenziale. La cosiddetta "NO determinazione x" dove nitriti e nitrati siano misurate insieme ha ben poco valore.
Diversi metodi per quantificare nitriti in vari campioni biologici sono stati sviluppati – il più comune è il più antico, basato sulla reazione di Griess che era stato originariamente descritto in 1879. Anche con modificatio modernans, il limite di sensibilità per i nitriti ottenibile con il metodo di Griess 'è nella gamma micromolare bassa. Chemiluminescenza (CL), in combinazione con tri-ioduro riducendo soluzione, è attualmente considerato il metodo più sensibile, che consente la quantificazione in gamma bassa nanomolari della concentrazione di nitriti 1-8,10,11. Lo stesso metodo CL, combinato con vanadio (III) cloruro di riduzione soluzione, può essere utilizzato per misurazioni sensibili di nitrato, con precisione nell'intervallo nanomolare 9.
CL rileva libera gas NO. Pertanto, nitriti, nitrati, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosamine (R-NNO), o composti metallo-NO (più tardi nel manoscritto di cui come "R- (X) -NO"), deve essere convertito in liberare gas NO al fine di quantificare il loro valore originale via CL. La conversione in NO viene effettuata mediante diverse soluzioni riducenti diversi, a seconda della natura del NO metabolita. Dopo la conversione, libera gas NO viene estratta dal recipiente di reazione da un gas carrier (He, N2 o Ar) nella camera di reazione di CL analizzatore cui l'ozono (O 3) è combinato con NO per formare biossido di azoto (NO 2) nel suo stato attivato. Con il ritorno allo stato fondamentale, NO 2 * emette nella regione infrarossa e fotone emesso viene rilevato da fotomoltiplicatore (PMT) dello strumento CL. L'intensità della luce emessa è direttamente proporzionale alla concentrazione di NO in camera di reazione, che permette di calcolare la concentrazione della specie originali usando curve di taratura adeguate.
Nel nostro protocollo, in primo luogo abbiamo presente determinazione CL a base di nitriti e nitrati nelle situazioni cliniche più utilizzate – nel sangue e di plasma, e poi discutiamo come determinare questi ioni in campioni di tessuto. Spiegheremo anche nel dettaglio come preservare la concentrazione di nitrito fisiologica originale in ambienti nitriti reattivo, come il sangue e suoi scomparti, plasma e globuli rossi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi critici all'interno del protocollo
Aliquote di tutte le soluzioni (tra cui l'acqua) usate per preparare, diluire o altrimenti trattare campioni originali devono essere salvati e controllati per possibili nitriti o (più spesso) contaminazione da nitrati. Abbiamo trovato che la maggior contaminazione proviene da acqua e molti prodotti chimici usati per il trattamento di campioni (ferricianuro in particolare) contengono anche significativa quantità di contaminazione da nitrati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vogliono riconoscere i contributi critici di Dr A. Dejam e MM Pelletier a sviluppare l'uso di soluzione di nitrito di preservare per le misure di nitriti nel sangue.
Materials
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
References
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