Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode
Summary
Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.
Abstract
Stikstofoxide (NO) is een van de belangrijkste regulator moleculen in vasculaire homeostase en ook een neurotransmitter. Enzymatisch geproduceerde NO wordt geoxideerd tot nitriet en nitraat door interacties met diverse oxy-heem eiwitten en andere nog niet bekende paden. Het omgekeerde proces, was reductie van nitriet en nitraat in NO ontdekt in zoogdieren in het laatste decennium en wordt steeds meer aandacht als een van de mogelijke wegen ofwel voorkomen of verlichten van een hele reeks cardiovasculaire, metabole en spierziekten waarvan men vermoedt dat worden geassocieerd met een verminderde niveaus van NO. Het is daarom belangrijk om de hoeveelheid NO en zijn metabolieten schatten verschillende lichaamscompartimenten – bloed, lichaamsvloeistoffen en de verschillende weefsels. Bloed, vanwege de goede bereikbaarheid, is de geprefereerde compartiment wordt gebruikt voor de schatting van NO metabolieten. Vanwege de korte levensduur (paar milliseconden) en lage sub-nanomolaire concentratie, directe betrouwbare metingen van het bloed NO <em> In vivo huidige grote technische problemen. Aldus NO beschikbaarheid wordt meestal geschat op basis van de hoeveelheid van de oxidatieproducten, nitriet en nitraat. Deze twee metabolieten worden altijd apart gemeten. Er zijn verschillende goed gevestigde werkwijzen om de concentraties in biologische vloeistoffen en weefsels te bepalen. Hier presenteren we een protocol voor chemoluminescentiemethode (CL), gebaseerd op spectrofotometrische detectie van NO na nitriet of nitraat door tri-jodide of vanadium (III) chloride-oplossing, respectievelijk. De gevoeligheid voor nitriet en nitraat opsporing is in lage nanomolaire bereik, die CL stelt als de meest gevoelige methode die momenteel beschikbaar zijn voor veranderingen in NO metabole routes te bepalen. We in detail uitleggen hoe je monsters van biologische vloeistoffen en weefsels te bereiden met het oog op de originele hoeveelheid nitriet en nitraat aanwezig op het moment van de collectie en hoe ze hun respectieve bedragen in monsters te bepalen behouden. Beperkingen van de CL-techniek zijn ook explained.
Introduction
Nitriet, en in mindere breiden nitraat in bloed tijdens algemene toestand van lichaam NO metabolisme. Nitriet concentraties in het bloed en de meeste organen en weefsels zijn alleen in hoge nanomolaire of lage micromolaire bereik, nitraat gewoonlijk aanwezig in veel hogere hoeveelheden – in het micromolaire bereik. Veranderingen in nitrietniveaus door ziekteprogressie of veranderingen in voedingsgewoonten zijn vrij klein en alleen kan worden gemeten met een zeer gevoelige methode. Vanwege hun verschillende niveaus en metabolische processen, afzonderlijke bepaling van nitriet en nitraat niveau essentieel. Zogenaamde "NOx bepaling" wanneer nitriet en nitraat elkaar gemeten heeft weinig waarde.
Verschillende werkwijzen voor het kwantificeren nitriet in diverse biologische monsters ontwikkeld – de meest voorkomende is de oudste, gebaseerd op het Griess reactie die oorspronkelijk in 1879 had beschreven Zelfs met moderne WIJZIGIns, de gevoeligheid grenswaarde voor nitriet haalbaar door Griess 'methode is in de lage micromolaire bereik. Chemiluminescentie (CL), in combinatie met tri-jodide reducerende oplossing, wordt momenteel beschouwd als de meest gevoelige methode, waardoor kwantificatie in het lage nanomolaire bereik van nitrietconcentraties 1-8,10,11. Dezelfde methode CL combinatie met vanadium (III) chloride reducerende oplossing, kan worden gebruikt voor gevoelige metingen van nitraat, nauwkeurig in het nanomolaire gebied 9.
CL detecteert vrij gas NO. Daarom nitriet, nitraat, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosoamines (R-NNO) of metaal-verbindingen NO (later in manuscript genoemd "R- (X) -NO"), worden omgezet in vrij NO gas teneinde de oorspronkelijke hoeveelheid gekwantificeerd via CL. Conversie naar NO wordt bereikt met verschillende reducerende oplossingen, afhankelijk van de aard van de NO metaboliet. Na de conversie wordt vrij NO gas verwijderd uit het reactievat door een dragergas (He, N2 of Ar) in de reactiekamer van CL analysator waarin ozon (O 3) wordt gecombineerd met NO om stikstofdioxide (NO 2) in de geactiveerde toestand. Bij terugkeer naar de grondtoestand, NO 2 * uitzendt in infrarode gebied en uitgezonden foton wordt gedetecteerd door fotomultiplicator (PMT) van CL instrument. De intensiteit van het uitgezonden licht is rechtevenredig met NO-concentratie reactiekamer, waarop de berekening van de concentratie van de oorspronkelijke soorten met de juiste calibratie curves maakt.
In ons protocol, we eerst het huidige CL op basis van de bepaling van nitriet en nitraat in de meest gebruikte klinische instellingen – in het bloed en plasma, en dan bespreken we hoe deze ionen in de weefselmonsters te bepalen. Ook nader uiteen hoe de oorspronkelijke fysiologische nitrietconcentratie in nitrietvrije reactieve omgevingen, zoals bloed en de compartimenten, plasma en rode bloedcellen te behouden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Monsters van alle oplossingen (inclusief het water) wordt gebruikt voor te bereiden, te verdunnen of op andere wijze te behandelen originele monsters moeten worden opgeslagen en gecontroleerd op mogelijke nitriet of (vaker) de verontreiniging door nitraten. We vonden dat de meeste vervuiling afkomstig is van water en vele chemicaliën die worden gebruikt bij de behandeling van het monster (ferricyanide in het bijzonder) aanzienlijk deel van de verontreiniging d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs willen kritische bijdragen van Dr A. Dejam en MM Pelletier erkennen in de ontwikkeling van het gebruik van nitriet behoud oplossing voor de nitriet metingen in het bloed.
Materials
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
References
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
- Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
- Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E., Hancock, J. T. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. 476, 11-28 (2008).
- Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
- Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
- Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
- Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
- Smárason, A. K. 1., Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).
- Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
- Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
