Måling nitritt og nitrat, metabolitter i nitrogenoksid Pathway, i biologisk materiale ved hjelp av Chemiluminescence Method

Summary

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Abstract

Nitrogenoksid (NO) er en av de viktigste regulator molekylene i vaskulær homeostasis og også en nevrotransmitter. Enzymatisk produsert NO oksideres til nitritt og nitrat ved interaksjoner med ulike oksygen-heme proteiner og andre fortsatt ikke kjente veier. Den omvendte prosessen, reduksjon av nitritt og nitrat til NO hadde blitt oppdaget hos pattedyr i det siste tiåret, og det er å få oppmerksomhet som en av de mulige veier å enten forebygge eller lindre en rekke hjerte, metabolske og muskelsykdommer som antas å være assosiert med reduserte nivåer av NO. Det er derfor viktig å estimere mengden av NO og dets metabolitter i forskjellige kroppsrom – blod, kroppsvæsker og de forskjellige vev. Blod, på grunn av sin lett tilgjengelighet, er den foretrukne rommet benyttes for estimering av NO metabolitter. På grunn av sin korte levetid (noen få millisekunder) og lav sub-nanomolar konsentrasjon, direkte målinger av blod ingen pålitelig <em> in vivo bød på store tekniske problemer. Dermed NO tilgjengelighet er vanligvis beregnet basert på mengden av sin oksidasjonsprodukter, nitritt og nitrat. Disse to metabolitter alltid måles separat. Det er flere godt etablerte metoder for å bestemme deres konsentrasjoner i biologiske væsker og vev. Her presenterer vi en protokoll for kjemiluminescens-metoden (CL), basert på spectrophotometrical deteksjon av NO etter nitritt eller nitrat reduksjon med tri-jodid eller vanadium (III) klorid-løsninger, respektivt. Følsomheten for nitritt og nitrat påvisning er i lav nanomolar rekkevidde, som setter CL som den mest sensitive metoden for tiden tilgjengelig for å bestemme endringer i NO stoffskifte. Vi forklarer i detalj hvordan du skal forberede prøver fra biologiske væsker og vev for å bevare opprinnelige mengder nitritt og nitrat til stede på tidspunktet for innsamling og hvordan å bestemme deres respektive mengder i prøver. Begrensninger av CL teknikken er også explained.

Introduction

Nitritt, og til en mindre forlenge nitrat-nivåer i blod reflektere generelle tilstanden av kropps NO metabolisme. Nitritt konsentrasjoner i blodet og i de fleste organer og vev er bare i høy nanomolar eller lavt mikromolområde, er vanligvis til stede i mye større mengder nitrat – i mikromolområde. Endringer i nitritt nivåer på grunn av sykdomsprogresjon eller endringer i kostvaner er ganske små og kan bare måles ved hjelp av en svært følsom metode. På grunn av deres svært ulike nivåer og ulike metabolske prosesser, er separat bestemmelse av nitritt og nitrat nivåer avgjørende. Såkalte "NO _x vilje", der nitritt og nitrat blir målt sammen har svært liten verdi.

Flere fremgangsmåter for å kvantifisere nitritt i forskjellige biologiske prøver har blitt utviklet – de vanligste er den eldste, basert på Griess-reaksjonen som ble opprinnelig beskrevet i 1879. Selv med moderne modifications, er følsomheten grense for nitritt oppnåelig ved Griess 'metode i lavt mikromolområde. Kjemiluminescens (CL), kombinert med tri-jodid reduserende oppløsning, blir for tiden betraktet som den mest følsom metode, slik at kvantifisering i det lave nanomolare området av nitritt konsentrasjoner ^1-8,10,11. Den samme fremgangsmåte CL, kombinert med vanadium (III) klorid reduserende oppløsning, kan anvendes for sensitive målinger av nitrat, med presisjon i det nanomolare området ^9.

CL oppdager fri gass NO. Derfor nitritt, nitrat, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosoaminer (R-NSFs), eller metall-NO forbindelser (senere i manuskriptet omtalt som "R- (X) -INGEN"), må konverteres til gratis ingen gass for å kvantifisere sine opprinnelige mengder via CL. Omdannelse til NO oppnås ved hjelp av flere forskjellige reduserende løsninger, avhengig av innholdet av NO-metabolitten. Etter konvertering, er gratis NO gass fjernes fra reaksjonsbeholderen av en bæregass (He, N2 eller Ar) inn i reaksjonskammeret av CL-analysator hvor ozon _(O3) er kombinert med NO under dannelse av nitrogendioksid _(NO2) i sin aktiverte tilstand. Med retur til grunntilstanden, NO ₂ * avgir infrarød regionen og slippes foton blir oppdaget av photomultiplier (PMT) av CL instrument. Intensiteten av emittert lys er direkte proporsjonal med NO-konsentrasjon i reaksjonskammeret, noe som tillater beregning av den konsentrasjon av den opprinnelige arter ved hjelp av egnede kalibreringskurver.

I vår protokoll, vi først stede CL-basert bestemmelse av nitritt og nitrat i de mest brukte kliniske settinger – i blod og plasma, og da vi diskutere hvordan å bestemme disse ionene i vevsprøver. Vi forklarer også i detalj hvordan å bevare den opprinnelige fysiologiske nitritt-konsentrasjonen i nitritt-reaktive miljøer, for eksempel blod og dets avdelinger, plasma og røde blodceller.

Protocol

Alle protokoller, inkludert bruk av dyr ble godkjent for bruk av NIDDK Animal Care og bruk komité og menneskeblod ble hentet fra NIH Blood bank fra friske givere. 1. Prøvepreparering Utarbeidelse av nitritt bevare løsning Fremstille en oppløsning inneholdende 890 mM kaliumferricyanid (K 3 Fe (CN) 6), og 118 mM NEM (N-etylmaleimid) i destillert vann. Løs opp godt før det er klart gul med krystaller stede. Legg NP-40 (oktyl pheno…

Representative Results

Figur 2 viser representative resultater innhentet fra standarder og fem forskjellige prøver. Som vist i denne figur, fotomultiplikatorer spenningen øker umiddelbart etter nitritt-inneholdende oppløsning (standarder eller prøver) blir injisert inn i reduserende oppløsning (injeksjonstider er angitt med røde pilene under kurven) og går tilbake til grunnlinjeverdien når alle nitritt er tilstede i den injiserte oppløsningen ble redusert. Det er også klart fra denne…

Discussion

Kritiske trinn i protokollen

Porsjoner av alle løsninger (inkludert vann) som brukes til å tilberede, utvanning eller på annen måte behandle originale prøvene må lagres og sjekkes for mulig nitritt eller (oftere) nitrat forurensning. Vi fant at de fleste forurensning kommer fra vann og mange kjemikalier som brukes til å behandle prøven (ferricyanide spesielt) også inneholde betydelige mengder nitrat forurensning i noen masse som forstyrrer den endogene nitrat besluttsomhet. Vi sjekker …

Materials

potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385
sulfanilamide; AS	Sigma	S9251
HCl	Sigma	H1758
acetic acid, glacial	Sigma	A9967
ascorbic acid	Sigma	A7506
potassium iodide; KI	Sigma	60399
iodine; I2	Sigma	207772	light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2	Sigma	563218
vanadium(III) chloride; VCl3	Sigma	208272	ligt sensitive, toxic
GentleMac	Miltenyi
Sievers NOA 280i	GE
CLD 88Y	Ecophysics