Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von
Summary
Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.
Abstract
Stickstoffmonoxid (NO) ist einer der wichtigsten Reglermolekülen in der vaskulären Homöostase und auch ein Neurotransmitter. Enzymatisch erzeugte NO wird durch Wechselwirkungen mit verschiedenen Oxy-Häm-Proteine und andere noch nicht bekannte Wege in Nitrit und Nitrat oxidiert. Der umgekehrte Vorgang, Reduzierung von Nitrit und Nitrat in NO hatte bei Säugetieren in den letzten zehn Jahren entdeckt worden, und es gewinnt Aufmerksamkeit als einer der möglichen Wege entweder zu verhindern oder eine ganze Reihe von Herz-Kreislauf-, Stoffwechsel- und Muskelerkrankungen lindern, die gedacht sind mit verminderter NO-Spiegel in Verbindung gebracht werden. Es ist daher wichtig, die Menge von NO und seinen Metaboliten in verschiedenen Kompartimenten abzuschätzen – Blut, Körperflüssigkeiten und den verschiedenen Geweben. Blut, aufgrund seiner leichten Zugänglichkeit ist die bevorzugte Fach für die Abschätzung der NO-Metaboliten verwendet. Aufgrund seiner kurzen Lebensdauer (einige Millisekunden) und niedrige subnanomolarer Konzentration, direkte zuverlässige Messungen des Blut NO <em> in vivo vor große technische Schwierigkeiten. Somit wird keine Verfügbarkeit in der Regel bezogen auf die Menge der Oxidationsprodukte, Nitrit und Nitrat geschätzt. Diese beiden Metaboliten werden immer separat gemessen. Es gibt mehrere gut etablierte Methoden ihre Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten und Geweben zu bestimmen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Chemilumineszenz-Methode (CL) bezogen auf spektrophotometrische Detektion von NO nach Nitrit oder Nitrat-Reduktion durch Triiodid-oder Vanadium (III) chlorid-Lösungen, respectively. Die Empfindlichkeit für Nitrit und Nitrat-Erkennung ist in niedrigen nanomolaren Bereich, der CL als die empfindlichste Methode setzt derzeit zur Verfügung stehenden Änderungen der NO Stoffwechselwege zu bestimmen. Wir erklären im Detail, wie Proben aus biologischen Flüssigkeiten und Geweben herzustellen, um zu bewahren ursprünglichen Mengen an Nitrit und Nitrat anwesend zum Zeitpunkt der Sammlung und wie ihre jeweiligen Mengen in Proben zu bestimmen. Einschränkungen der CL-Technik sind auch explained.
Introduction
Nitrite und zu einem weniger verlängern Nitrat-Spiegel im Blut reflektieren Gesamtzustand der Körper nicht den Stoffwechsel. Nitrit-Konzentrationen in Blut und die meisten Organe und Gewebe sind nur in hohen nanomolaren oder niedrigen mikromolaren Bereich, Nitrat in wesentlich höheren Mengen in der Regel vorhanden ist – in mikromolaren Bereich. Änderungen in der Nitritwerte wegen Krankheitsprogression oder Veränderungen der Ernährungsgewohnheiten sind recht klein und kann nur über eine sehr empfindliche Methode gemessen werden. Aufgrund ihrer sehr unterschiedlichen Ebenen und mit unterschiedlichen Stoffwechselprozesse, separate Bestimmung von Nitrit und Nitratgehalt ist von wesentlicher Bedeutung. So genannte "NO x Bestimmung" von Nitrit und Nitrat gemessen werden zusammen hat sehr wenig Wert.
Mehrere Verfahren zur Nitrit in verschiedenen biologischen Proben zu quantifizieren entwickelt wurden – die häufigste die älteste, basiert auf der Griess-Reaktion, die mit modernen modificatio in 1879. Selbst ursprünglich beschrieben worden warns, ist die Empfindlichkeitsgrenze für Nitrit erreichbar durch Griess 'Methode in niedrigen mikromolaren Bereich. Chemilumineszenz (CL), kombiniert mit Tri-Jodid – Lösung zu reduzieren, ist derzeit die empfindlichste Methode betrachtet, so dass eine Quantifizierung im niedrigen nanomolaren Bereich von Nitritkonzentrationen 1-8,10,11. Das gleiche Verfahren CL, kombiniert mit Vanadin (III) -chlorid – Lösung zu reduzieren, kann für empfindliche Messungen von Nitrat verwendet werden, mit Präzision im nanomolaren Bereich 9.
CL erkennt freies Gas NO. Daher, Nitrit, Nitrat, R-Nitrosothiole (R-SNO), R-Nitrosoamine (R-NNO) oder Metall-NO-Verbindungen (später in Manuskript bezeichnet als "R- (X) -NO") muss in umgewandelt werden frei von NO-Gas, um ihre ursprünglichen Beträge über CL zu quantifizieren. Umwandlung zu NO ist, mehrere verschiedene Reduktionslösungen erreichen mit, je nach Art des NO-Metaboliten. Nach der Umwandlung wird frei NO-Gas aus dem Reaktionsgefäß durch ein Trägergas (He, N gespült2 oder Ar) in die Reaktionskammer von CL – Analysator , wo Ozon (O 3) mit NO kombiniert wird Stickstoffdioxid (NO 2) in seinem aktivierten Zustand zu bilden. Mit Rückkehr zum Grundzustand, NO 2 * emittiert im Infrarotbereich und emittierten Photons durch Photomultiplier (PMT) von CL Instrument detektiert. Die Intensität des emittierten Lichts ist direkt proportional zur NO-Konzentration in der Reaktionskammer, die Berechnung der Konzentration der ursprünglichen Spezies unter Verwendung geeigneter Kalibrierungskurven ermöglicht.
In unserem Protokoll haben wir zunächst vorliegende CL-basierte Bestimmung von Nitrit und Nitrat in den am häufigsten verwendeten klinischen Einstellungen – im Blut und Plasma, und dann besprechen wir, wie diese Ionen in Gewebeproben zu bestimmen. Wir erklären auch im Detail, wie die ursprüngliche physiologischen Nitritkonzentration in Nitrit-reaktive Umgebungen zu erhalten, wie zum Beispiel Blut und seine Fächer, Plasma und roten Blutkörperchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Aliquots aller Lösungen (einschließlich Wasser), die zur Herstellung, verdünnt oder anderweitig Originalproben zu behandeln haben für mögliche Nitrit oder (häufiger) Nitratbelastung gespeichert und überprüft werden. Wir fanden, dass die meisten Verunreinigungen von Wasser kommt, und viele Chemikalien verwendet Probe (ferricyanide insbesondere) zur Behandlung auch erhebliche Menge an Nitratbelastung in einigen Partien enthalten, die mit dem end…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autoren wollen bei der Entwicklung der Verwendung von Nitrit Konservierungslösung für die Nitrit-Messungen in Blut kritischen Beiträge von Dr. A. entstören und MM Pelletier zu bestätigen.
Materials
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
References
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