Analyse af Simian Immunodeficiency Virus-specifikke CD8<sup> +</sup> T-celler i makakaber efter Peptid-MHC-I tetramerfarvning
Summary
Her præsenteres en optimeret protokol til optælle og karakterisering af rhesus makak CD8 + T-celler mod AIDS-virus. Denne artikel er ikke kun nyttig til området for HIV immunologi, men også til andre områder af biomedicinsk forskning, hvor CD8 + T-cellereaktioner er kendt for at påvirke udfaldet sygdom.
Abstract
Peptid-dominerende histokompatibilitetskompleks klasse I (pMHC-I) tetramerer har været et uvurderligt værktøj til at studere CD8 + T-cellereaktioner. Fordi disse reagenser direkte binde til T-celle-receptorer på overfladen af CD8 + T-lymfocytter, fluorochrommærkede pMHC-I tetramerer muliggøre nøjagtig påvisning af antigen (Ag) -specifik CD8 + T-celler uden behov for in vitro-re -stimulation. Desuden, når kombineret med flerfarvede flowcytometri, kan pMHC-I tetramerfarvning afsløre vigtige aspekter af Ag-specifikke CD8 + T-celler, herunder differentiering fase, hukommelse fænotype, og aktiveringsstatus. Disse typer af analyser har været særligt anvendelige inden for HIV immunologi, hvor CD8 + T-celler kan påvirke progression til AIDS. Eksperimentel infektion af rhesus-makakaber med abeimmundefektvirus (SIV) tilvejebringer et uvurderligt værktøj til at studere cellulær immunitet mod AIDS-virus. Som følge heraf betydelig PROGREss er gjort med at definere og karakterisere T-celle responser i denne dyremodel. Vi præsenterer her en optimeret protokol for optælling SIV-specifikke CD8 + T-celler i makakaber efter pMHC-I tetramerfarvning. Vores assay tillader den samtidige kvantificering og hukommelse fænotypebestemmelse af to pMHC-I tetramer + CD8 + T-cellepopulationer pr test, som kan være nyttig til at spore SIV-specifikke CD8 + T-celle-responser frembragt af vaccination eller SIV-infektion. I betragtning af relevansen af ikke-humane primater inden for biomedicinsk forskning, denne metode kan anvendes til at studere CD8 + T-celle responser i flere indstillinger sygdom.
Introduction
CD8 + T-celler omfatter en afgørende komponent i det adaptive immunsystem, som de deltager i tumor immun overvågning og bidrage til udryddelse af intracellulære patogener 1. I enkle vendinger, CD8 + T-celler udtrykker T-cellereceptorer (TCR'er), som specifikt genkender peptid-dominerende histokompatibilitetskompleks klasse I (pMHC-I) molekyler til stede på plasmamembranen af værtscellerne. Da disse peptider er afledt af proteolyse af endogent syntetiserede proteiner, celleoverflade pMHC-I-komplekser give et vindue ind i intracellulære miljø. Ved virusinfektion, for eksempel, vil inficerede celler udviser MHC-I-molekyler, der indeholder virus-afledte peptider, der kan tjene som ligander for TCR udtrykt af patruljerer CD8 + T-celler. I tilfælde en virus-specifikke CD8 + T-celle møder en inficeret celle præsenterer sin pMHC-I-ligand, vil TCR engagement resultere i CD8-aktivering + T-celle og Ultiende føre til at målrette cellelyse. I betragtning af den kritiske karakter af disse TCR / pMHC-I-interaktioner, bestemmelse af størrelsen, specificitet og fænotype for at reagere CD8 + -T-celler kan ofte afsløre vigtige fingerpeg om humane sygdomme.
Indtil begyndelsen af 1990'erne, kvantificering af Ag-specifikke CD8 + T-celler har påberåbt sig den teknisk krævende begrænsende fortynding assay (LDA) 2,3. Ikke kun gjorde LDA kræve flere dage at være afsluttet, er det heller ikke at opdage celler, der manglede proliferative potentiale. Som et resultat heraf LDA voldsomt undervurderet den faktiske frekvens af antigen (Ag) -specifikke CD8 + -T-celler, der deltager i en immunreaktion. Selv om udviklingen af ELISPOT og intracellulære cytokin farvende assays stærkt forbedret evnen til at måle cellulær immunitet, disse metoder stadig påkrævet in vitro-stimulering til kvantificering Ag-specifikke T-celler 4. Det var ikke før 1996, at Altman, Davis, og colleagues offentliggjort deres skelsættende artikel rapporterer udviklingen af pMHC-I tetramer teknologi 5. Afgørende for succes af denne teknik var den multimerisering af pMHC-I-molekyler, der forlængede halveringstiden af TCR / pMHC-I-interaktioner, og derved reducere sandsynligheden for pMHC-I tetramerer falde ned under vaske- trinnene flowcytometriske assays. Den største fordel ved pMHC-I tetramerer forhold til de ovennævnte assays er evnen til nøjagtigt at detektere Ag-specifikke CD8 + T-celler direkte ex vivo uden behov for in vitro restimulering. Desuden er en kombination af pMHC-I tetramerfarvning med flerfarvede flowcytometri har tilladt detaljerede analyser af differentieringstrinet, hukommelse fænotype, og aktiveringsstatus af Ag-specifikke CD8 + T-celler 2-4. I lyset af de seneste tekniske fremskridt til karakterisering CD8 + T-celle repertoirer af pMHC-I multimer farvning 6, bredden af applikationer for denne metode vil sandsynligvis fortsætte med at udvide.
Kun få områder i biomedicinsk forskning har nydt mere fra pMHC-I tetramerfarvning end inden for HIV immunologi 7. Selvom CD8 + T-celler var blevet tidsmæssigt tilknyttet det oprindelige kontrol af HIV viræmi på tidspunktet for offentliggørelsen af Altman, Davis, og kolleger 8,9, brug af pMHC-I tetramerer i de følgende år væsentligt udvidet vores forståelse af HIV-specifikke CD8 + T-celle-respons. For eksempel pMHC-I tetramerfarvning bidrage til at bekræfte den robuste størrelse virus-specifikke CD8 + T-celle-responser i de fleste HIV-inficerede individer 10-12. Denne metode lettede også karakteriseringen af HIV og SIV-specifikke CD8 + T-celle-responser begrænset af MHC-I-molekyler associeret med spontan kontrol af viral replikation i fravær af antiretroviral behandling-et fænomen kendt som "elite kontrol" <sup> 13-15. Endvidere pMHC-I tetramerer var med til at etablere den programmerede død 1 (PD-1) / PD ligand 1 (PD-L1) akse som en reversibel pathway for dysfunktionel fænotype af HIV-specifikke CD8 + T-celler i ukontrolleret kronisk infektion 16,17. Kollektivt, disse undersøgelser understreger anvendeligheden af pMHC-I tetramerer til overvågning CD8 + T-cellereaktioner mod AIDS-virus.
Eksperimentel SIV-infektion af rhesus makakaber (Macaca mulatta) er fortsat den bedste dyremodel for at evaluere immune indgreb mod hiv / aids 18,19. I de seneste 25 år er der sket betydelige fremskridt i identifikation og karakterisering af SIV-specifikke CD8 + T-celler i denne abearter, herunder opdagelsen af MHC-I alleler og definitionen af peptid bindende motiver 13,20-27 . Som følge heraf har pMHC-I tetramerer blevet udviklet til analyse af SIV-specifikke CD8 + T-cellereaktioner i denne dyremodel 28. De fleste af disse reagenser er lavet af genprodukterne af fire rhesus makak MHC-I-alleler: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, og Mamu-B * 017: 01. Notatet gør rhesus makakaber ikke udtrykke en MHC-C locus 29. Langt størstedelen af de pMHC-I tetramerer anvendt i de foreliggende eksperimenter blev produceret hos NIH Tetramer Core Facility fra Emory University. Ikke desto mindre er nogle af disse reagenser, herunder Mamu-A1 * 001 tetramerer bundet til immundominerende Gag CM9 epitop, kan kun opnås fra kommercielle kilder på grund af licensaftaler. Brug af pMHC-I tetramerer af de fire rhesus macaque alleler anført ovenfor, har vi med succes opregnet CD8 + T-celler mod i alt 21 SIV epitoper (tabel 1), som blev induceret ved vaccination eller primær SIV infektion 30,31 (Martins et al., upublicerede observationer).
Den foreliggende manuskript tilvejebringer enoptimeret pMHC-I tetramerfarvning protokol til bestemmelse af frekvensen og hukommelse fænotypen af SIV-specifikke CD8 + T-celler i makakaber. Assayet begynder med en elektiv 30 minutters inkubation med et protein kinase inhibitor (PKI, her er Dasatinib anvendt) for at reducere TCR-internalisering og derved forbedre pMHC-I tetramerfarvning 32. Som beskrevet nedenfor, denne behandling er især nyttig, når du bruger Mamu-B * 017: 01 tetramerer. Instruktioner om, hvordan til at mærke cellerne med fluorokromkonjugerede pMHC-I tetramerer og monoklonale antistoffer (MAB) findes også. Denne protokol omfatter også en celle permeabilisering trin for den intracellulære detektion af cytolyse-associerede molekyle granzym B (Gzm B). MAb mod CD3 tilsættes ved dette trin, samt at forbedre påvisningen af denne TCR signalmolekyle. Som reference er alle fluorochromer anvendes i denne farvning panel angivet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et par skridt i denne procedure fortjeneste diskussion, da de er afgørende for at give optimale resultater. Først, da kvaliteten af de biologiske prøver er en stærk indikator for succes for enhver flowcytometrisk assay 38, skal der tages alle omhu for at sikre, at cellerne er levedygtige og i suspension under farvningen procedure. Dette er særlig relevant, når der arbejdes med kryopræserverede prøver, da de er mere tilbøjelige til at klumpe og indeholder typisk højere antal døde celler. I disse til…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke David Watkins til at understøtte de eksperimenter, gjorde det muligt for optimering af den nuværende metode. Forskning rapporteret i denne publikation blev delvist understøttet af en pilot tilskud fra Miami Center for AIDS Research af National Institutes of Health under award nummer P30AI073961. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P., Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. , 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with “escaped” virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. . The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. , 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
