L'analisi dei Simian Immunodeficiency Virus specifici CD8<sup> +</sup> T-cellule in Rhesus macachi di peptide-MHC-I Tetramero colorazione
Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l'enumerazione e la caratterizzazione di cellule macaco rhesus T CD8 + contro il virus dell'AIDS. Questo articolo è utile non solo al campo della immunologia HIV, ma anche ad altri settori della ricerca biomedica cui sono note le risposte delle cellule T CD8 + influenzare l'esito della malattia.
Abstract
Istocompatibilità di classe complesso Peptide-major I (pMHC-I) tetrameri sono state uno strumento prezioso per studiare le risposte delle cellule T CD8 +. Poiché questi reagenti si legano direttamente ai recettori delle cellule T sulla superficie delle cellule CD8 + linfociti T, tetrameri fluorocromi marcato pMHC-I consentono il rilevamento accurato di antigene (Ag) + SPECIFICI CD8 T-cellule senza la necessità di re in vitro -stimolazione. Inoltre, se combinato con multicolore citometria a flusso, pMHC-I tetramero colorazione può rivelare aspetti chiave di Ag-specifici CD8 + T-cellule, tra cui fase di differenziazione, la memoria fenotipo, e lo stato di attivazione. Questi tipi di analisi sono stati particolarmente utile nel campo della immunologia HIV dove CD8 + T-cellule possono influenzare la progressione in AIDS. infezione sperimentale di macachi rhesus con virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) fornisce uno strumento prezioso per studiare l'immunità cellulare contro il virus dell'AIDS. Come risultato, notevole progress è stato fatto nel definire e caratterizzare le risposte delle cellule T in questo modello animale. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l'enumerazione SIV-specifica CD8 + T-cellule in macachi Rhesus di pMHC-I tetramero colorazione. Il nostro test permette la simultanea quantificazione e la memoria fenotipizzazione di due popolazioni CD8 + pMHC-I tetramero + T-cellule per test, che potrebbe essere utile per il monitoraggio SIV-specifiche risposte delle cellule T CD8 + generati dalla vaccinazione o infezione SIV. Considerando la rilevanza di primati non umani nella ricerca biomedica, questa metodologia è applicabile per studiare le risposte delle cellule T CD8 + in più impostazioni di malattia.
Introduction
CD8 + T-cellule comprendono una componente fondamentale del sistema immunitario adattativo, come partecipano tumore sorveglianza immunitaria e contribuire alla eradicazione di patogeni intracellulari 1. In termini semplici, CD8 + T-cellule esprimono i recettori delle cellule T (TCR), che riconoscono specificamente di istocompatibilità di classe complessi peptide-major I (pMHC-I) molecole presenti sulla membrana plasmatica delle cellule ospiti. Poiché questi peptidi sono derivati dalla proteolisi di proteine sintetizzate endogeno, pMHC-I superficie cellulare complessi forniscono una finestra nell'ambiente intracellulare. Al momento l'infezione da virus, per esempio, le cellule infettate mostrerà molecole MHC-I contenenti peptidi del virus di derivazione che possono servire come leganti per TCR espresse da pattugliamento CD8 + T-cellule. Nel caso in cui un CD8 + cellule T specifiche per il virus incontra una cellula infetta presentando il suo ligando pMHC-I, TCR impegno si tradurrà in attivazione + cellule T CD8 e ultinell'intervallo portare a destinazione la lisi cellulare. Data la natura critica di queste interazioni TCR / pMHC-I, che determina la grandezza, la specificità, e fenotipo di rispondere CD8 + T-cellule possono spesso rivelare importanti indizi circa le malattie umane.
Fino ai primi anni 1990, la quantificazione di Ag-specifici CD8 + T-cellule invocato il saggio tecnicamente impegnativo diluizione limite (LDA) 2,3. Non solo la LDA ha richiesto diversi giorni per essere completato, ma anche omesso di rilevare le cellule che mancava potenziale proliferativo. Come risultato, la LDA notevolmente sottovalutato la frequenza effettiva di antigene (Ag) specifico d'CD8 + T-cellule che partecipano a una risposta immunitaria. Sebbene lo sviluppo di ELISPOT e dosaggi di citochine colorazione intracellulare notevolmente migliorato la capacità di misurare l'immunità cellulare, questi metodi ancora necessari a stimolazione in vitro per la quantificazione Ag-specifiche cellule T 4. Non è stato fino al 1996 che Altman, Davis, e Colleagues pubblicato il loro punto di riferimento articolo segnalato la sviluppo della tecnologia tetramero pMHC-I 5. Fondamentale per il successo di questa tecnica è stata la multimerizzazione delle molecole pMHC-I, che si estendevano l'emivita delle interazioni TCR / pMHC-I, riducendo così la probabilità di tetrameri pMHC-I cadono fuori durante le fasi di lavaggio dei dosaggi di citometria a flusso. Il vantaggio principale di tetrameri pMHC-I sopra i saggi suddetti è la capacità di rilevare con precisione Ag-specifica CD8 + T-cellule direttamente ex vivo senza la necessità di in vitro ri-stimolazione. Inoltre, la combinazione di pMHC-I tetramero colorazione con multicolore citometria a flusso ha consentito analisi dettagliate della fase di differenziazione, la memoria fenotipo, e lo stato di attivazione di Ag-specifici CD8 + T-cellule 2-4. Alla luce dei recenti progressi tecnici per la caratterizzazione repertori + CD8 T-cellule da pMHC-I Multimer colorazione 6, l'ampiezza di applicazioni FOR questa metodologia è destinata a continuare in espansione.
Poche zone nella ricerca biomedica hanno beneficiato di più dal pMHC-I tetramero colorazione di campo dell'HIV dell'immunologia 7. Anche se CD8 + T-cellule erano state temporalmente associato al controllo iniziale di viremia HIV dal momento della pubblicazione da Altman, Davis, e colleghi hanno 8,9, l'uso di tetrameri pMHC-I, negli anni successivi notevolmente ampliato la nostra comprensione di HIV-specifica CD8 + risposta T-cellulare. Ad esempio, pMHC-I tetramero colorazione aiutato confermare la dimensione robusta di risposte delle cellule T virus-specifici CD8 + nella maggior parte delle persone con infezione da HIV 10-12. Questa metodologia anche facilitato la caratterizzazione di HIV e SIV-specifici + risposte delle cellule T CD8 limitato da molecole MHC-I associate al controllo spontaneo della replicazione virale in assenza di terapia antiretrovirale, un fenomeno noto come "controllo elite" <sup> 13-15. Inoltre, pMHC-I tetrameri hanno contribuito a stabilire l'asse morte programmata 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) come un percorso reversibile per il fenotipo disfunzionale di + HIV-specifica CD8 T-cellule nel infezione cronica non controllata 16,17. Collettivamente, questi studi sottolineano l'utilità di tetrameri pMHC-I per monitorare le risposte delle cellule T CD8 + contro il virus dell'AIDS.
Sperimentale infezione SIV di macachi Rhesus (Macaca mulatta) rimane il migliore modello animale per la valutazione degli interventi del sistema immunitario contro l'HIV / AIDS 18,19. Negli ultimi 25 anni, sono stati compiuti notevoli progressi nella identificazione e caratterizzazione di SIV-specifica CD8 + T-cellule in questa specie di scimmie, tra cui la scoperta di alleli MHC-I e la definizione di binding peptide motivi 13,20-27 . Come risultato, pMHC-I tetrameri sono stati sviluppati per l'analisi di SIV-specifica CD8 + T-cellulerisposte in questo modello animale 28. La maggior parte di questi reagenti sono realizzati i prodotti genici di quattro macaco rhesus alleli MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu-B * 017: 01. Da segnalare, macachi Rhesus non esprimono un MHC-C locus 29. La stragrande maggioranza dei tetrameri pMHC-ho utilizzato nelle attuali esperimenti sono stati prodotti presso l'impianto di NIH Tetramero core alla Emory University. Tuttavia, alcuni di questi reagenti, compresi Mamu-A1 * 001 tetrameri legati alla immunodominante epitopo Gag CM9, può essere ottenuto solo da fonti commerciali a causa di accordi di licenza. Uso tetrameri pMHC-I dei quattro alleli macaco rhesus elencati sopra abbiamo elencato con successo CD8 + T-cellule contro un totale di 21 epitopi SIV (Tabella 1), che sono stati indotta dalla vaccinazione o infezione primaria SIV 30,31 (Martins et al., osservazioni non pubblicate).
Il presente manoscritto fornisce unaottimizzato protocollo tetramero colorazione pMHC-I per determinare il fenotipo frequenza e la memoria di SIV-specifici CD8 + cellule T nei macachi rhesus. Il test inizia con un elettivo 30 min di incubazione con un inibitore della proteina chinasi (PKI, qui, Dasatinib è utilizzato) al fine di diminuire TCR internalizzazione e quindi migliorare pMHC-I tetramero colorazione 32. Come descritto di seguito, questo trattamento è particolarmente utile quando si utilizza Mamu-B * 017: 01 tetrameri. Sono inoltre disponibili le istruzioni su come etichettare le cellule con tetrameri pMHC-I coniugato a un fluorocromo e anticorpi monoclonali (MAK, MAB). Questo protocollo include anche un passo permeabilizzazione cella per la rilevazione intracellulare della citolisi associata molecola granzyme B (GZM B). Il mAb contro CD3 viene aggiunto in questa fase anche per migliorare la rilevazione di questa molecola di segnalazione TCR. Come riferimento, vengono elencati tutti i fluorocromi impiegati in questo pannello colorazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pochi passi in questa discussione di merito procedura in quanto sono cruciali per cedere risultati ottimali. Innanzitutto, poiché la qualità dei campioni biologici è un forte predittore del successo di qualsiasi citometria a flusso 38, tutto occorre prestare attenzione a garantire che le cellule sono vitali e in sospensione durante la procedura di colorazione. Questo è particolarmente importante quando si lavora con campioni crioconservati poiché sono più inclini a formazione di grumi e contengono tip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare David Watkins per supportare gli esperimenti che hanno permesso l'ottimizzazione del presente metodologia. La ricerca riportato nella presente pubblicazione è stato sostenuto in parte da una sovvenzione pilota fornito dal Miami Center for AIDS Research del National Institutes of Health con il numero premio P30AI073961. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P., Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. , 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with “escaped” virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. . The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. , 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
