Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8<sup> +</sup> T-Zellen in Rhesusaffen von Peptid-MHC-I Tetramerfärbung
Summary
Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für das Aufzählen und Rhesusaffe CD8 + T – Zellen gegen das AIDS – Virus zu charakterisieren. Dieser Artikel ist nützlich , nicht nur auf dem Gebiet der HIV Immunologie, sondern auch auf anderen Bereichen der biomedizinischen Forschung , wo CD8 + T – Zell – Reaktionen bekannt sind , Krankheitsverlauf zu beeinflussen.
Abstract
Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (pMHC–I) Tetramere haben ein unschätzbares Werkzeug gewesen CD8 + T-Zell – Reaktionen zu untersuchen. Da diese Reagenzien binden direkt an T-Zell – Rezeptoren auf der Oberfläche von CD8 + T-Lymphozyten, Fluorochrom-markiertem pMHC-I Tetramere ermöglichen , die genaue Erfassung von Antigen (Ag) -spezifische CD8 + T-Zellen ohne die Notwendigkeit einer in vitro Re -Stimulation. Wenn darüber hinaus mit Mehrfarben kombiniert Durchflusszytometrie kann pMHC-I Tetramerfärbung Schlüsselaspekte der Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen zeigen, einschließlich Differenzierungsstadium, Gedächtnis Phänotyp und Aktivierungsstatus. Diese Arten von Analysen wurden besonders nützlich auf dem Gebiet der HIV Immunology wo CD8 + T-Zellen , das Fortschreiten zu AIDS beeinflussen können. Experimentelle Infektion von Rhesus-Makaken mit Simian Immunodeficiency Virus (SIV) stellt ein unschätzbares Werkzeug zelluläre Immunität gegen das AIDS-Virus zu untersuchen. Als Ergebnis erhebliche progress wurde bei der Definition und Charakterisierung T-Zell-Antworten in diesem Tiermodell hergestellt. Wir stellen hier ein optimiertes Protokoll für Aufzählen SIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in rhesus macaques durch pMHC-I Tetramer-Färbung. Unser Assay erlaubt die gleichzeitige Quantifizierung und Speicher Phänotypisierung von zwei pMHC-I Tetramer + CD8 + T-Zell – Populationen pro Test, der für die Verfolgung von SIV-spezifischen CD8 + T-Zell – Antworten , die durch Impfung oder SIV – Infektion nützlich sein könnten. CD8 + T-Zellantworten in mehreren Krankheitseinstellungen unter Berücksichtigung der Relevanz von nicht – menschlichen Primaten in der biomedizinischen Forschung, ist diese Methode anwendbar für die Untersuchung.
Introduction
CD8 + T-Zellen umfassen eine entscheidende Komponente des adaptiven Immunsystems , wie sie in Tumor – Immunüberwachung und tragen zur Eradikation intrazellulärer Pathogene 1 teilnehmen. In einfachen Worten auszudrücken CD8 + T-Zellen T-Zell – Rezeptoren (TCR) , die spezifisch Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (pMHC–I) Moleküle auf der Plasmamembran der Wirtszellen erkennen. Da diese Peptide aus der Proteolyse von endogen synthetisierten Proteinen, Zelloberflächen pMHC-I-Komplexe liefern ein Fenster in die intrazelluläre Umgebung abgeleitet werden. Nach der Virusinfektion, zum Beispiel, werden infizierte Zellen zeigen MHC-I – Moleküle Virus abgeleitete Peptide enthält , die als Liganden für TCRs ausgedrückt durch patrouillieren CD8 + T-Zellen dienen kann. Im Falle einer infizierten Zelle präsentiert ein Virus-spezifischen CD8 + T-Zelle ihre pMHC-I – Liganden trifft, wird TCR Eingriff resultieren in CD8 + T-Zell – Aktivierung und ultifähr führen Zell-Lyse zu zielen. In Anbetracht der kritischen Natur dieser TCR / pMHC–I – Wechselwirkungen, die Bestimmung der Größe, Spezifität und Phänotyp reagieren CD8 + T-Zellen können offenbaren oft wichtige Hinweise auf Krankheiten beim Menschen.
Bis in die frühen 1990er Jahre, die Quantifizierung von Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen auf der technisch anspruchsvollen Grenzverdünnung Assays herangezogen (LDA) 2,3. Nicht nur, dass mehrere Tage die LDA erfordern abgeschlossen werden, ist es auch nicht, Zellen zu erkennen, die proliferative Potential fehlte. Als Ergebnis unterschätzt die LDA in beträchtlichem Ausmaß die tatsächliche Häufigkeit von Antigen (Ag) -spezifische CD8 + T-Zellen in einer Immunantwort beteiligt. Obwohl die Entwicklung von ELISPOT und intrazellulären Zytokin – Färbung Assays die Fähigkeit stark verbesserte zelluläre Immunität zu messen, benötigt diese Methoden noch in – vitro – Stimulation zur Quantifizierung von Ag-spezifischen T-Zellen 4. Erst 1996, dass Altman, Davis, und colleagues ihre Wahrzeichen Artikel veröffentlicht , die Entwicklung der 5 – Technologie pMHC–I Tetramer berichten. Entscheidend für den Erfolg dieser Technik war die Multimerisierung von pMHC-I-Moleküle, die die Halbwertszeit von TCR / pMHC-I-Wechselwirkungen erweitert, wodurch die Wahrscheinlichkeit pMHC-I Tetramere während der Waschschritte von durchflusszytometrischen Assays Abfallen reduzieren. Der Hauptvorteil der pMHC-I – Tetramere in den vorgenannten Tests ist die Fähigkeit, genau Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen direkt ex vivo , ohne die Notwendigkeit für in vitro Restimulation detektieren. Darüber hinaus hat die Kombination von pMHC-I Tetramer – Färbung mit Mehrfarben – Zytometrie detaillierte Analysen der Differenzierungsstufe, Speicher Phänotyps erlaubt fließen und Aktivierungsstatus von Ag-spezifischen CD8 + T-Zellen 2-4. In Anbetracht der jüngsten technischen Fortschritte für die Charakterisierung von CD8 + T-Zell – Repertoires durch pMHC–I – Multimer Färbung 6, die Breite der Anwendungen for diese Methode ist wahrscheinlich, weiter zu wachsen.
Nur wenige Gebiete in der biomedizinischen Forschung haben mehr profitierte von pMHC–I Tetramerfärbung als dem Gebiet der HIV Immunologie 7. Obwohl CD8 + T-Zellen zeitlich mit der anfänglichen Kontrolle der HIV – Virämie durch den Zeitpunkt der Veröffentlichung von Altman, Davis und Kollegen 8,9 in Verbindung gebracht worden war, unser Verständnis für die Verwendung von pMHC–I Tetrameren in den folgenden Jahren deutlich ausgebaut die HIV-spezifischen CD8 + T-Zell – Antwort. Zum Beispiel half pMHC-I Tetramerfärbung die robust Größe von Virus-spezifischen CD8 + T-Zell – Reaktionen in den meisten HIV-infizierten Personen 10-12 bestätigen. Diese Methode erleichtert auch die Charakterisierung von HIV- und SIV-spezifischen CD8 + T-Zell – Antworten beschränkt durch MHC-I – Moleküle mit spontaner Kontrolle der viralen Replikation in Abwesenheit von antiretroviralen Therapie-Phänomen als "Elite – control" bekannt assoziiert <sup> 13-15. Weiterhin wurden pMHC-I Tetramere instrumental bei der Festlegung der programmierten Tod 1 (PD-1) / PD – Ligand 1 (PD-L1) Achse als reversible Weg für die dysfunktionale Phänotyp von HIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in unkontrollierter chronischen Infektion 16,17. Zusammenfassend unterstreichen diese Studien die Nützlichkeit pMHC-I Tetramere zur Überwachung CD8 + T-Zell – Reaktionen gegen das AIDS – Virus.
Experimentelle SIV – Infektion von Rhesusaffen (Macaca mulatta) bleibt das beste Tiermodell für 18,19 Immun Interventionen gegen HIV / AIDS zu bewerten. In den letzten 25 Jahren erhebliche Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung von SIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in dieser Affenarten, einschließlich der Entdeckung von MHC-I – Allele und die Definition von Peptid – Bindungsmotive hergestellt 13,20-27 . Als Ergebnis wurden für die Analyse von SIV-spezifischen CD8 + T-Zell – pMHC-I Tetramere entwickelteAntworten in diesem Tiermodell 28. Die meisten dieser Reagenzien werden der Genprodukte von vier Rhesusaffe MHC-I – Allele hergestellt: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01 und Mamu-B * 017: 01. Zu beachten ist , Rhesusmakaken exprimieren keine MHC-C – Locus 29. Die überwiegende Mehrheit der pMHC–I-Tetramere in den vorliegenden Experimenten verwendet wurden bei der NIH Tetramer Core Facility an der Emory University produziert. Dennoch können einige dieser Reagenzien, einschließlich Mamu-A1 * 001 Tetrameren die immuno-Gag CM9 Epitop gebunden ist, nur aus kommerziellen Quellen aufgrund von Lizenzverträgen erworben werden. Verwendung pMHC-I Tetramere der vier Rhesusaffe Allele oben aufgeführten haben wir erfolgreich aufgezählt CD8 + T-Zellen gegen insgesamt 21 Epitope SIV (Tabelle 1), die durch Impfung oder primäre SIV – Infektion 30,31 (Martins et induziert wurden al., nicht veröffentlichte Beobachtungen).
Die vorliegende Manuskript stellt einoptimiert pMHC-I Tetramer Färbeprotokoll die Frequenz und die Speicher Phänotyp von SIV-spezifischen CD8 + T-Zellen in rhesus macaques zu bestimmen. Der Test beginnt mit einer elektiven 30 min Inkubation mit einem Proteinkinase – Inhibitor (PKI, hier Dasatinib verwendet wird), um TCR – Internalisierung zu verringern und dadurch verbessern pMHC-I Tetramer 32 Anfärbung. Wie unten beschrieben, ist diese Behandlung besonders nützlich, wenn Mamu-B * 017 unter Verwendung von: 01-Tetramere. Die Anleitung, wie die Zellen mit fluorochromkonjugierten pMHC–I Tetrameren und monoklonale Antikörper (mAb) zu beschriften sind ebenfalls vorhanden. Dieses Protokoll umfasst auch eine Zellpermeabilisierung Schritt für die intrazellulären Nachweis des Zytolyse-assoziierten Moleküls Granzym B (GZM B). Der mAb gegen CD3 wird bei diesem Schritt hinzugefügt, und Nachweis dieses TCR Signalmoleküls zu verbessern. Als Referenz, die alle in dieser Färbung Platte eingesetzt Fluorochrome werden aufgelistet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein paar Schritte in diesem Verfahren Verdienst Diskussion, wie sie sind entscheidend für optimale Ergebnisse liefert. Erstens, weil die Qualität der biologischen Proben ein starker Prädiktor für den Erfolg eines Durchflusszytometrie – Assay 38 ist, müssen alle darauf zu achten, dass die Zellen lebensfähig und in Suspension während der Färbung sind. Dies ist besonders relevant, wenn sie mit kryokonservierten Proben arbeiten, da sie anfälliger für Verklumpung und enthalten typischerweise eine höhere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten, dass David Watkins für die Unterstützung der Experimente zu danken, die die Optimierung der vorliegenden Methodik ermöglicht. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde teilweise durch einen Piloten Zuschuss zur Verfügung gestellt von der Miami-Zentrum für AIDS-Forschung der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer P30AI073961 unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P., Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. , 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with “escaped” virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. . The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. , 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
