जालिका और माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत का अध्ययन द्वारा<em> बगल में</em> निकटता Ligation परख तय कोशिकाओं में
Summary
यहाँ, हम तय कोशिकाओं में कल्पना और जालिका और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच बातचीत अंतर्जात उच्च संवेदनशीलता के साथ यों तो एक प्रक्रिया का वर्णन। प्रोटोकॉल एक माइटोकॉन्ड्रिया जुड़े झिल्ली इंटरफेस में inositol 1,4,5-triphosphate रिसेप्टर / ग्लूकोज विनियमित प्रोटीन 75 / वोल्टेज पर निर्भर आयनों चैनल / cyclophilin डी जटिल को निशाना सीटू निकटता बंधाव परख में अनुकूलित की सुविधा है।
Abstract
Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.
Introduction
माइटोकांड्रिया और जालिका (ईआर) सेल में स्वतंत्र अंगों नहीं हैं, लेकिन वे संपर्क साइटों माइटोकॉन्ड्रिया जुड़े जालिका झिल्ली (एमएएम) के रूप में परिभाषित में संरचनात्मक और कार्यात्मक बातचीत। वास्तव में, MAMS क्षेत्रों में जहां ईआर की झिल्ली और माइटोकॉन्ड्रिया बारीकी apposed कर रहे हैं के अनुरूप, दोनों पक्षों से प्रोटीन के बीच बातचीत की इजाजत दी। बहरहाल, इन अंगों की झिल्लियों इन क्षेत्रों के भीतर फ्यूज नहीं है, इसलिए वे अपनी अलग संस्थाओं बनाए रखें। MAMS, माइटोकॉन्ड्रिया के लिए ईआर से एक महत्वपूर्ण (सीए 2) कैल्शियम में भूमिका और फॉस्फोलिपिड हस्तांतरण खेलने ऊर्जा चयापचय और सेल अस्तित्व 1-3 प्रभावित।
ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच सहयोग पहली इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ 1970 के दशक में कल्पना की गई थी। तब से, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 4,5, इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी 6.7 या ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया विशेष की fluorophore इम्युनो-स्थानीयकरणएस / फ्लोरोसेंट प्रोटीन 8 प्रतिष्ठित ईआर माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। एमएएम के विश्लेषण के लिए एक और उपयोगी उपकरण subcellular विभाजन के उपयोग पर आधारित है। यह अंतर ultracentrifugation एक Percoll ढाल 9 के लिए युग्मित द्वारा एमएएम अंशों के अलगाव की अनुमति देता है। हालांकि, अंतिम उत्पाद समृद्ध एमएएम भिन्न, बजाय शुद्ध अंशों में शामिल है। कुल मिलाकर, इन रणनीतियों का विशेष रूप से संवेदनशील और / या मात्रात्मक नहीं हैं, और वे आसानी से बड़ी स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। वैकल्पिक रूप से, दवा-inducible फ्लोरोसेंट अंतर-organelle linkers का उपयोग कर आनुवंशिक दृष्टिकोण में उभरा है, लेकिन वे प्रोटीन 10 की अंतर्जात अभिव्यक्ति के स्तर पर organelle बातचीत के विश्लेषण की अनुमति नहीं है।
एमएएम 11 पर IP3R / GRP75 / VDAC परिसर के Szabadkai की खोज पर आधारित है, हम ईआर माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक विधि विकसित की है। हम सीटू निकटता ligati में इस्तेमाल कियापरख का पता लगाने और VDAC1 और IP3R1 के बीच बातचीत यों तो दो organelle-सतह प्रोटीन तय कोशिकाओं 12 में एमएएम इंटरफेस में सीए 2 -channeling परिसर में शामिल किया गया। संक्षेप में, हम बाहरी mitochondrial झिल्ली (माउस विरोधी VDAC1 प्राथमिक एंटीबॉडी) और IP3R1 ईआर झिल्ली पर (खरगोश विरोधी IP3R1 प्राथमिक एंटीबॉडी) (चित्रा 1, एक पैनल) पर VDAC1 की जांच की। फिर, परख के अनुसार, हम दोनों विरोधी माउस और विरोधी खरगोश आईजीजी (माउस और खरगोश निकटता बंधाव परख जांच) है, जो पूरक oligonucleotide एक्सटेंशन संयुग्मित हैं जोड़ा। दो लक्षित प्रोटीन 40 एनएम से नीचे दूरी पर हैं, ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स एक परिपत्र डीएनए टेम्पलेट (चित्रा 1, पैनल बी) के गठन की अनुमति देने के लिए बाद में जोड़ा कनेक्टर ओलिगोस के साथ संकरण कर सकते हैं। यह परिपत्र डीएनए अणु ligated है और प्रवर्धित, covalently निकटता जांच में से एक से जुड़ी एक एकल असहाय डीएनए उत्पाद बनाने (चित्रा 1, पैनल ग) </stroएनजी>। एमएएम इंटरफेस में ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच की दूरी को 25 एनएम 6, निकटता बंधाव और प्रवर्धन किया जा सकता है, बाद में पता लगाने के लिए अग्रणी टेक्सास रेड लेबल ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स जांच (चित्रा 1, पैनल डी के संकरण के कारण 10 एनएम से पर्वतमाला के बाद )। प्रत्येक फ्लोरोसेंट डॉट इस प्रकार व्यक्ति की कोशिकाओं में सीटू ईआर माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता VDAC1 / IP3R1 के बीच बातचीत का प्रतिनिधित्व करता है।
चित्रा 1: द्वारा जालिका-माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत का पता लगाने के योजनाबद्ध चित्रण सीटू निकटता Ligation परख में। क) एक माउस प्राथमिक एंटीबॉडी VDAC1 और एक खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी IP3R1 के खिलाफ निर्देशित एमएएम इंटरफेस में निकटता में उनकी epitopes करने के लिए बाध्य कर सकते हैं के खिलाफ निर्देशित, ख) निकटता बंधाव जांच की एक जोड़ी के अलावामाउस और खरगोश आईजीजी के खिलाफ निर्देशित। ये जांच डीएनए किस्में है कि कनेक्टर ओलिगोस के बंधाव के लिए टेम्पलेट्स फार्म कर सकते हैं संलग्न है। ग) बंधाव के बाद गठित परिपत्र डीएनए किनारा टेक्सास रेड लेबल oligonucleotides का उपयोग कर से परिलक्षित किया जा सकता है और डी) एक फ्लोरोसेंट डॉट के रूप में माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सीटू निकटता बंधाव परख प्रयोगों में इसी प्रकार के एंटीबॉडी के GRP75 / IP3R1 जोड़ी, साथ ही cyclophilin डी (CypD) के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है / IP3R1 एंटीबॉडी, विचार है कि CypD एमएएम इंटरफेस में IP3R / GRP75 / VDAC परिसर के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया था 12-14।
Protocol
Representative Results
Discussion
Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हमारी प्रयोगशाला में सभी लोगों को जो अनुकूलन और प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए योगदान धन्यवाद। इस काम INSERM और राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-09-JCJC-0116 और ANR-11-BSV1-033-02) द्वारा समर्थित किया गया। ईटी उच्च शिक्षा और अनुसंधान के फ्रेंच मंत्रालय से एक शोध फैलोशिप द्वारा उसे पीएचडी के दौरान समर्थन किया था।
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | |
| Glycine | Sigma | G-8898 | |
| Triton | Sigma | T8532 | |
| 35mm Glass bottom culture dishes | MatTeK corporation | P35G-0-14-C | |
| Blocking solution | Sigma | DUO-92004 or DUO-92002 | provided in the Duolink PLA probes, Sigma |
| VDAC1 antibody | Abcam | ab14734 | |
| IP3R1-H80 antibody | Santa Cruz | sc28614 | |
| CypD antibody | Abcam | ab110324 | |
| Grp75 antibody | Santa Cruz | sc13967 | |
| TBS 10X | euromedex | ET220 | Dilute to obtain 1X |
| Tween 100X | euromedex | 2001-B | dilute in TBS to obtain 0,01% |
| PLA Probes Mouse MINUS | Sigma | DUO-92004 | Duolink, Sigma |
| PLA Probes Rabbit PLUS | Sigma | DUO-92002 | Duolink, Sigma |
| Duolink detection reagents red | Sigma | DUO-92008 | Duolink, Sigma |
| Ligation solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Ligase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Amplification solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Polymerase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Duolink Mounting Medium | Sigma | DUO80102 | Duolink, Sigma |
| Softwares: | |||
| Blob-finder software | BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm | ||
| ImageJ software | Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html |
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