Summary

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

Published: December 23, 2016
doi:

Summary

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Abstract

kendi yapısını ve fonksiyonunu incelemek için proteinlere kimyasal sondaları tanıtmak için mevcut şu anda birçok kimyasal araç vardır. Faydalı bir yöntem, genetik olarak bioorthogonal fonksiyonel grubu ihtiva eden bir doğal olmayan amino asidin sokulması protein konjugasyon olup. Bu rapor, site-spesifik bir antikor konjugasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklamaktadır. protokol bir azid içeren amino asitin genetik dahil, ve zorlanma-terfi azid-alkin siklo (SPAAC) tarafından konjugasyon reaksiyonu için deneysel ayrıntıları içerir. Bu soy-destekli Reaksiyon fizyolojik pH ve sıcaklıkta reaksiyona moleküllerin basit karıştırma ile ilerler ve bakır (I) 'iyonları ve bakır kenetleme ligandlar olarak ilave reaktifler gerektirmez. Bu nedenle, bu yöntem, genel protein konjugasyon ve antikor ilaç konjugatları (ADC) geliştirilmesi için yararlı olabilecektir.

Introduction

Escherichia coli içinde bir p -methoxyphenylalanine genetik dahil belirtildikten sonra, 1 100'den doğal olmayan amino asitler (UAA'lar) başarılı bir şekilde çeşitli proteinlerin dahil edilmiştir. Bu UAAS arasında 1-3, bioorthogonal fonksiyonel grupları içeren amino asitler yoğun çalışılan ve büyük oranını temsil edilmiştir. UAAS kullanılan bioorthogonal fonksiyonel gruplar, keton, 4 azit 5 alkin, 6 sikloostin, 7 tetrazin, 8 α, β-doymamış bir amid, 9 norbonen, 10 transcyclooctene, 11 ve bisiklo [6.1.0] -nonyne bulunmaktadır. Her fonksiyonel grubun avantajları ve dezavantajları vardır 11 da, azid ihtiva eden amino asitler en yaygın protein konjugasyon için kullanılmıştır. p -Azidophenylalanine (AF), azido-içeren amino asitler bir, hali hazırda mevcuttur, ve dahil efficiency mükemmel. Bu amino asidi içeren mutant proteinler bakır katalitik siklo veya SPAAC göre cyclooctynes ​​sahip alkinler ile reaksiyona sokulabilir. 12-20

Son zamanlarda, biopharmaceuticals ilaç endüstrisinde büyük ilgi çekmiştir. Antikor-ilaç konjugatı (ADC) bağlı insan kanserlerinin 21 ve tedavisi için hedeflenen bir tedavi için kabiliyetleri de avantajlı terapötik bir antikor sınıfı diğer hastalıklar. 50'den fazla ADC klinik çalışmalarda şu anda, ve sayısı hızla artmaktadır. ADC'ler geliştirilmesinde birçok faktör etkinliğini en üst düzeye çıkarmak ve yan etkileri en aza indirmek için dikkate alınması gerekir. Bu faktörler arasında, etkin ve yere-özgü konjugasyonu reaksiyonu, bir antikor arasında bir kovalent bağ oluşturmak üzere bir ilacın önemlidir. Konjugasyon reaksiyonu istenen etkinlik ve spesifikliği, bir bir bioorthogonal fonksiyonel grup ile konjugasyon ile elde edilebilirözellikle, bir antikor içine dahil edilir, doğal olmayan bir amino asit. Burada 22-26, biz bir protokol rapor sitenin spesifik dahil bir antikor fragmanına AF biyokimyasal prob mutant antikor fragmanı konjuge.

Protocol

1. Plazmid Yapı Bir His 6 Etiketleme-hedef antikor geni (pBAD-HerFab-WT) ifade edecek bir ifade plazmid (pBAD-HerFab-L177TAG) Construct ve kehribar kodonu ile lösin-177 için kodonu replace (TAG) 27 kullanılarak konvansiyonel saha-yönlendirilmiş mutagenez tekniği. Malzemelerin Tablo bakın. Gelişti tRNA Tyr ve aminoasil-tRNA sentetaz (Aars) çifti için genleri içeren başka bir ifade plazmid (pEVOL-AFRS) Construct. UAAS etkin dahil ed…

Representative Results

Bu çalışmada, bir antikor parçası örneğin bir bölgeye özel fragmanına bir azid ihtiva eden amino asit içeren ve gergin sikloostin mutant antikor fragmanının reaksiyona sokulmasıyla bir florofor ile konjuge (Şekil 1). HerFab AF bir azid ihtiva eden amino asit dahil edildiği içine hedef antikor fragmanı olarak seçilmiştir. AF değiştirilmesi için HerFab kalıntı seçmek için HerFab X-ışını kristal yapısı analiz edilmiştir. Kalıntının…

Discussion

proteinlerin içine Doğal olmayan amino asitlerin genetik dahil protein modifikasyonu için kullanılan diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Önemli avantajlar 1-3 bir proteinin her türlü genel uygulanabilmesidir. Prensip olarak, bir hedef proteini ve protein, bir hedef sitesi seçiminde herhangi bir sınırlama yoktur. Bununla birlikte, UAA ile yapısal ve fonksiyonel olarak önemli kalıntısının yerine, hedef proteinin yapısını ve fonksiyonunu değiştirerek neden olabilir. Genel ol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

1. plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRS Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1g
LB Broth BD Difco 244620 500g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25g
Agar SAMCHUN 214230 500g
SOC medium Sigma S1797 100ML
3. Expression and purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF) Bachem F-3075.0001 1g
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500ml
3.2 Cell lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% SAMCHUN E0064 1kg
Sucrose Sigma S9378 500g
Lysozyme Siyaku 126-0671 1g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25ml
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1ml capacity
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10ml
MES running buffer Thermofisher NP0002 500ml
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25g
Typhoon 9210 variable mode imager Amersham Biosciences

References

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -. J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -. J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, h. J., Kim, D. W., Lee, h. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

Play Video

Cite This Article
Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H. S. Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition. J. Vis. Exp. (118), e54922, doi:10.3791/54922 (2016).

View Video