Yeşil floresan protein ve lusiferaz muhabir ifade lentiviral parçacıklar ile hasta edilen ksenograftlan (PDXs) sabit etiketlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, birinci bölgede PDXs büyümesini izlemek, hem de in vivo görüntüleme sistemleri kullanarak kendiliğinden ve deney metastazları sağlar.
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
Cerrahi rezeksiyon tümör örnekleri doğrudan bağışıklık tehlikeye farelere aşılanan hasta kaynaklı tümör ksenograftlarının (PDXs), geliştirilmesi, standart hücre hattı ksenograft modelleri üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor ve kanser araştırmalarına 1,2 büyük bir ilerlemeyi temsil etmektedir. PDXs muhafaza ve birinci geçit yetiştirilen tümörün genetik ve biyolojik özelliklerinin çok az bir değişiklik ile arka arkaya geçişlerinin genişletilebilir; ve daha doğru bir insan kanser hücre çizgileri 3-8 türetilen ksenograftlarının göre tümör heterojenliğini yansıtmaktadır. Bu modeller artık yaygın ilaç geliştirme 6,11 bir preklinik bir platform olarak ve kanser biyoloji 4,12 eğitimi için deneysel bir araç olarak, kanser terapötikler 9,10 kişiselleştirmek için bir platform olarak kullanılır.
Çoğu PDXs implante ve fizibil kumpas kullanılarak zamanla tümör büyümesinin ölçümü sağlayan, deri altına yayılır. ancakMetastatik hastalık PDXs kullanarak model daha zor olmuştur. Özellikle meme kanseri, farklı organlara metastatik kapasiteli xenografts 3,5,13 tarif edilmiştir, fakat, metastatik sitelere kendiliğinden yayılma sıklığı, son derece düşüktür. rapor halinde, metastatik yükünün tanımlanması ve ölçülmesi otopsi hedef organların zahmetli histolojik incelemesinde dayanır. biyolojik olarak ışık veren (lusiferaz Luc) ya da floresan eksprese eden kanser hücre çizgileri (yeşil floresan protein GFP) geni muhabir yaygın beyin, akciğer, kemik ve karaciğer intrakardiyak sonra kuyruk damarından, intrafemoral ve dalak enjeksiyon göğüs kanseri metastazlarının deneysel modellerde kullanılan 14-16. bu modeller primer tümörlerden yayılması atlamak olurken, organ tropizm ve metastatik kolonizasyon mekanizmaları incelemek için değerlidir. Bununla birlikte, birincil, hasta tümörleri ve PDXs türetilen hücreler düşük transfeksiyon ya da transdüksiyon oranları usin olabilirg standart prosedürler. Bir alternatif daha sonra geleneksel doku kültür protokolleri kullanılarak etiketlenebilir vitro 17'de PDX-türevi hücre hatlarının kurmaktır. Ancak bu yaklaşım, hücre hattı türetilmesi zordur ve hücrelerin fenotipini değişebilen en PDXs, etiketleme için uygun değildir. Burada, in vivo görüntüleme için uygun lentiviral vektörleri ile PDX-ayrışmış tümör hücrelerinin transdüksiyonu için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, bağışıklık yetersizliği olan farelerde ayrışmış Luc-GFP etiketli PDX hücreleri intrakardiyak enjeksiyonu ile deneysel metastaz tarif eder.
Gen-haberci ifade lentivirüs PDX-ayrışmış organoids transdüksiyonu için temel protokol daha önce 18 tarif edilmiştir. Mevcut protokolde, insan tümör hücreleri zenginleştirmek ve% 100 transdüksiyon verimliliği yakınındaki elde yanı sıra deney göğüs kanserinin tespit edilmesi için etiketli PDXs kullanımı için ek yöntemler tarifmetastaz. Bu protokol, birden fazla kanser, çeşitli ışık saçan ve flüoresan işaretler ile PDXs türleri yanı sıra, gen ekspresyonu (ilgi genlerinin yani shRNA demonte) modülasyonunu etiketlenmesi için uyarlanabilir.
Protokolü içinde kritik adımlar:
In vitro transdüksiyon sırasında medya kompozisyonu dikkatli kontrol sağlar kadar yüksek titre lentiviral parçacıkların kullanımı (> 10 8 TU / ml), bu protokolün başarısında kritik bir adımdır. Yüksek titreli viral parçacıkların üretimi için birden fazla yöntem de 18,19 anlatılmış olmasına rağmen, Bu protokol, ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi üretilen lentiviral parçac…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, bu çalışmalarda kullanılan yüksek titre lentiviral üretimi için faj EF1aL-DsRed-UBC-GFP-B vektör ve protokolleri temin Boston Üniversitesi'nde Dr. Darrel KOTTON ederiz. Bu çalışma .NCI P30CA046934 Merkezi hibe in vivo görüntüleme desteklenen DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) ve R01 CA140985 (CAS) tarafından finanse edildi ve doku kültürü Colorado AMC Üniversitesi çekirdekler.
DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
EGF | BD Biosciences | 354001 | |
Heparin | Sigma | H4784 | |
B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
Hepes | |||
10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
70um filters | Falcon | 7352350 | |
scalpels | Fisher | 22079690 | |
Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |