شارك في توطين علامات النسب خلية والطماطم الإشارة
Summary
وضعنا مجموعتين من تتبع مجموعات في Rosa26 tdtomato (أعرب بتواجد مطلق في جميع الخلايا) / لجنة المساواة العرقية (أعرب تحديدا في غضروفية) الفئران: واحد مع 2.3Col1a1-GFP (محدد لبانيات) واحد مع المناعي (محددة لخلايا العظام). وتظهر البيانات أن التحول المباشر من غضروفية في خلايا العظام.
Abstract
تم استخدام نظام تتبع الخلية النسب في الغالب في دراسات علم الأحياء التطوري. استخدام لجنة المساواة العرقية recombinase يسمح لتفعيل مراسل في خط خلية معينة وجميع ذرية. هنا، استخدمنا النسب خلية تتبع تقنية لإثبات أن غضروفية تحول مباشرة إلى الخلايا بانية العظم وخلية عظمية خلال العظام الطويلة والتنمية لقمة الفك السفلي باستخدام نوعين من لجنة المساواة العرقية، Col10a1-لجنة المساواة العرقية وAggrecan-لجنة المساواة العرقية ERT2 (AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2)، عبرت مع Rosa26 tdTomato. وعلامات جيدا معترف بها على حد سواء Col10 وaggrecan لغضروفية.
على هذا الأساس، وضعنا نسب طريقة خلايا جديدة تتبع بالتزامن مع الفلورسنت مصير الخلايا المناعية لتحديد من خلال تحليل التعبير عن علامات معينة من الخلايا. كانت، Runx2 (علامة للخلايا المكونة للعظم في مرحلة مبكرة) والعاج المصفوفة protein1 (علامة للخلايا في وقت متأخر من مرحلة المكونة للعظم DMP1)تستخدم لتحديد خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية وحالة التمايز بهم. هذا المزيج يوسع ليس فقط تطبيق تتبع الخلية النسب، ولكن أيضا يبسط جيل من الفئران المجمع. الأهم من ذلك، يتم عرض الحالات عدد، والمكان، والتفريق بين ذرية الخلية الأم في وقت واحد، وتوفير مزيد من المعلومات من سلالة خلية تتبع وحدها. وفي الختام، وشارك في التطبيق من الخلايا النسب تتبع تقنيات والمناعي هو أداة قوية للتحقيق في بيولوجيا الخلايا في الجسم الحي.
Introduction
خلال التنمية، ويمثل تكوين العظام غضروفي لأكثر من 80٪ من حجم الهيكل العظمي. ويعتقد على نطاق واسع أن تبدأ مع موت الخلايا المبرمج للغضروفية التصنع. وفي وقت لاحق، والخلايا من نخاع العظام الكامنة تغزو والشروع الأوعية الدموية، تليها ترسب العظام الجديد كوسا- العظام والخلايا المشتقة السمحاق 1،2. مصير خلية من خلايا غضروفية الضخامي (المراكز الصحية)، ومع ذلك، فقد كانت قضية للنقاش على مدى عقود 3. في البداية، كانت تعتبر المراكز الصحية لتكون نهاية التمايز مسار خلية غضروفية، وموت الخلايا المبرمج كان يعتقد عموما أن يكون مصير النهائي من المراكز الصحية. الآن، يقترح بعض الباحثين أن بعض المراكز الصحية يمكن البقاء على قيد الحياة على الأقل، وتسهم في تكوين العظام غضروفي. على الرغم من أنها اقترحت أن النمو كان غضروفية لوحة القدرة على تحورها إلى بانيات بناء على التركيب الدقيق، وتلطيخ المناعى، والدراسات في المختبر 46، فإن أيا من هذه الأساليب ثيحرث نهائية في إثبات مساهمة خلية غضروفية إلى النسب بناء العظم.
توفر تقنية خلية النسب تتبع طريقة أكثر دقة لدراسة مصير الخلية. تحدث لفترة وجيزة، وهو الانزيم recombinase، وهو ما يعبر عنه فقط في نوع معين من الخلايا، ويحفز على التعبير عن الجينات المراسل. وبهذه الطريقة، وهذا النوع من الخلايا وأحفادهم وصفت بشكل دائم 7. ويستخدم نظام لجنة المساواة العرقية، loxP عادة في تتبع النسب. ولجنة المساواة العرقية (انزيم recombinase) استئصال تسلسل إيقاف بين المواقع loxP اثنين وتفعيل مراسل في خط خلية معينة (الشكل 1A). في بعض الحالات، يمكن للمحقق اختيار نقطة زمنية مواتية لتفعيل لجنة المساواة العرقية باستخدام المخدرات، مثل تاموكسيفين، مما تسبب في لجنة المساواة العرقية لصهر إلى صيغة معدلة من مستقبلات هرمون الاستروجين (لجنة المساواة العرقية ERT2) 8. أصبحت صحفيين الفلورسنت القياسية في نسب تتبع التجارب لأنها تقلل بشكل كبير من التعقيدوتحسين دقة وكفاءة مصير خلية تتبع 8،9. tdTomato ويصبح الخيار الأفضل بين صحفيين الفلورسنت لأنه لديه ألمع البروتين الفلوري وأقوى epifluorescence، مما يجعلها تصور بسهولة 7 (الشكل 1A).
باستخدام النسب Rosa26 tdTomato نظام تتبع، وقد أظهرت مجموعتنا وباحثون آخرون أن المراكز الصحية يمكن تغيير النمط الظاهري في خلايا العظام خلال تنمية 10-14. ولتحقيق ذلك، قمنا بتطوير مجموعتين من تتبع معا مع Rosa26 tdtomato (التعبير في كل مكان في كل خلايا) / لجنة المساواة العرقية (الخاصة غضروفية) الفئران: 2.3Col1a1-GFP (محددة لبانيات) والمناعي (محددة لخلايا العظام). وتظهر البيانات أن كلتا الطريقتين هي سبل ناجعة لدراسة مصير خلية في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
بسبب القيود التكنولوجية، فمن الصعب دائما للتحقيق في سلوك الخلايا في الجسم الحي. ومع ذلك، فإن تقنية خلية النسب تتبع يبرهن على أن تكون أداة قوية لدراسة بيولوجيا الخلية 7-9. في هذه الدراسة، ونحن زيادة تحسين هذا البروتوكول من خلال الجمع بين ذلك مع المناعي. وبهذه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
