Co-локализация клеточных клонов Маркеры и томата Signal
Summary
Мы разработали два набора трассировки комбинаций в Rosa26 tdtomato (экспрессируется во всех клетках) / Cre (специфически экспрессируется в хондроцитах) мышей: один с 2.3Col1a1-GFP (специфичными к остеобластов) и один с иммунофлюоресценции (специфичные для костных клеток). Полученные данные показывают, прямое превращение хондроцитов в костных клеток.
Abstract
Система отслеживания клеточных клонов была использована главным образом в развитии исследований по биологии. Использование Cre рекомбиназой позволяет активацию репортера в определенной клеточной линии, и все потомство. Здесь мы использовали клеточную линию трассировку технику , чтобы продемонстрировать , что хондроциты непосредственно превращаются в остеобласты и остеоциты во время длинных трубчатых костей и развития нижней челюсти мыщелка с использованием двух видов Cre, Col10a1-Cre и агрекана-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), скрещивают с Rosa26 tdTomato. Оба Col10 и аггрекан хорошо узнаваемым маркеры для хондроцитов.
Исходя из этого, мы разработали новый метод-клеточной линии трассировки в сочетании с флуоресцентной иммуногистохимии-клеток, чтобы определить судьбу путем анализа экспрессии специфических клеточных маркеров. Runx2 (маркер для остеогенных клеток на ранней стадии) и дентина матрица protein1 (DMP1, маркер для поздней стадии остеогенных клеток)используется для идентификации хондроцитов происхождения костных клеток и их состояние дифференцировки. Такое сочетание не только расширяет применение отслеживании клеточных клонов, но и упрощает генерацию сложных мышей. Что еще более важно, количество, расположение и дифференциации статусы родительской клетки потомстве отображаются одновременно, обеспечивая больше информации, чем клеточной линии отслеживания в одиночку. В заключение отметим , что совместное применение методов отслеживании клеточных клонов и иммунофлюоресценции является мощным инструментом для исследования клеточной биологии в естественных условиях.
Introduction
В процессе разработки, формирование эндохондральной кости приходится более 80% от объема скелета. Широко распространено мнение о том, что она начинается с апоптозом гипертрофических хондроцитов. Затем клетки из нижележащего костного мозга вторжению и инициировать ангиогенез, с последующим новым отложение костной ткани за счет костной marrow- и надкостницы клеток , полученных в 1,2 раза . Клетка судьба гипертрофированных хондроцитов (ГЦ), однако, был предметом споров в течение десятилетий 3. Первоначально ГЦ считались конец хондроцитов пути дифференцировки и апоптоза обычно считается окончательная судьба ГЦ. Теперь, некоторые исследователи предполагают, что по крайней мере некоторые HCs могли бы выжить и способствовать формированию эндохондральной кости. Несмотря на то, что они предложили , чтобы рост пластины хондроциты имел возможность трансформироваться в остеобласты , основанные на ультраструктуры, иммуногистохимического окрашивания, и в пробирке не изучает 46, ни один из этих методов шпрежде чем окончательное в демонстрации хондроцитов вклад в остеобластов линии.
Методика отслеживания клеточных клонов обеспечивает более строгий подход к изучению клеточной судьбы. Коротко говоря, рекомбиназа фермент, который экспрессируется только в определенном типе клеток, стимулирует экспрессию гена-репортера. Таким образом, этот тип клеток и их потомков постоянно помечены 7. Система Cre-LoxP обычно используется в трассировке линии. Cre (рекомбиназа фермент) будет эксцизии последовательности , то между двумя LoxP сайтов и активировать репортер в специфической клеточной линии (рисунок 1А). В некоторых случаях исследователь может выбрать благоприятный момент времени , чтобы активировать Cre с помощью лекарственного средства, такие как тамоксифен, в результате чего Cre сплавить с измененной формой рецептора эстрогена (CRE ERT2) 8. Флуоресцентные репортеры стали стандартом в линии отслеживания экспериментов, поскольку они резко снижают сложностьи повысить точность и эффективность клеточной судьбы кальку 8,9. tdTomato становится лучшим выбором среди флюоресцентных репортеров , поскольку она имеет самый яркий флуоресцентный белок и самый сильный эпифлуоресцентной, что делает его легко визуализировать 7 (рисунок 1А).
Используя родословие Rosa26 tdTomato трассировку системы, наша группа и другие исследователи показали , что ГЦ могут изменить свой фенотип в костных клеток в процессе развития 10-14. Для достижения этой цели , мы разработали два набора отслеживании комбинации с Rosa26 tdtomato (повсеместного выражение во всех клетках) / Cre (специфичными к хондроцитов) мышей: 2.3Col1a1-GFP (специфичными к остеобластов) и иммунофлюоресценции (характерные для костных клеток). Полученные данные показывают , что оба метода являются жизнеспособными пути исследования клеточной судьбы в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из – за технических ограничений, всегда трудно исследовать поведение клеток в живом организме . Тем не менее, метод трассировки клеточных клонов, оказывается мощным инструментом для изучения клеточной биологии 7-9. В данном исследовании мы улучшить этот протокол путем объеди?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
