सेल वंश मार्करों के सह स्थानीयकरण और टमाटर सिग्नल
Summary
इम्यूनोफ्लोरेसेंस साथ 2.3Col1a1-GFP के साथ एक (विशिष्ट अस्थिकोरक करने के लिए) और एक (अस्थि कोशिकाओं के लिए विशिष्ट): हम दो Rosa26 tdTomato (सर्वत्र सभी कोशिकाओं में व्यक्त) / Cre (विशेष chondrocytes में व्यक्त) चूहों में संयोजनों ट्रेसिंग के सेट विकसित की है। डेटा अस्थि कोशिकाओं में chondrocytes के प्रत्यक्ष परिवर्तन प्रदर्शित करता है।
Abstract
सेल वंश अनुरेखण प्रणाली विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में मुख्य रूप से इस्तेमाल किया गया है। Cre recombinase के उपयोग के लिए एक विशेष सेल लाइन और सभी संतान में रिपोर्टर के सक्रियण के लिए अनुमति देता है। यहाँ, हम दिखाना है कि chondrocytes सीधे लंबी हड्डी और जबड़े कंद विकास Cre, Col10a1 Cre और Aggrecan-CRE ERT2 (Agg-CRE ERT2) के दो प्रकार का उपयोग दौरान अस्थिकोरक और osteocytes में बदलना सेल वंश तकनीक अनुरेखण इस्तेमाल किया, Rosa26 के साथ पार tdTomato। दोनों Col10 और aggrecan chondrocytes के लिए अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त हैं मार्करों।
इस आधार पर, हम एक नई विधि-सेल वंश विशेष सेल मार्कर की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके फ्लोरोसेंट immunohistochemistry करने को परिभाषित सेल भाग्य के साथ संयोजन के रूप में विकसित किया अनुरेखण। Runx2 (प्रारंभिक अवस्था osteogenic कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) और Dentin मैट्रिक्स protein1 (DMP1; देर चरण osteogenic कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) थेउपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं और उनके भेदभाव स्थिति की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया। इस संयोजन न केवल सेल वंश ट्रेसिंग के आवेदन broadens, लेकिन यह भी यौगिक चूहों की पीढ़ी को सरल। इससे भी महत्वपूर्ण बात, माता पिता सेल संतान की संख्या, स्थान, और भेदभाव स्थितियों को एक साथ प्रदर्शित कर रहे हैं, सेल वंश अकेले ट्रेसिंग की तुलना में अधिक जानकारी प्रदान करते हैं। अंत में, सेल वंश अनुरेखण तकनीक और immunofluorescence के सह आवेदन vivo में कोशिका जीव विज्ञान की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
Introduction
विकास के दौरान, endochondral हड्डी गठन कंकाल की मात्रा का 80% से अधिक के लिए खातों। यह व्यापक रूप से माना जाता है कि यह hypertrophic chondrocytes की apoptosis के साथ शुरू होता है। बाद में, अंतर्निहित अस्थि मज्जा से कोशिकाओं पर आक्रमण और angiogenesis, हड्डी marrow- और periosteum व्युत्पन्न कोशिकाओं 1,2 द्वारा नई हड्डी बयान से पीछा आरंभ करें। Hypertrophic chondrocytes की सेल भाग्य (एचसीएस), तथापि, दशकों 3 के लिए बहस का एक मुद्दा रहा है। प्रारंभ में, HCS उपास्थिकोशिका भेदभाव मार्ग के अंत माना जाता था, और apoptosis आम तौर पर HCS के अंतिम भाग्य होने लगा था। अब, कुछ शोधकर्ताओं का सुझाव है कि कम से कम कुछ HCS जीवित है और endochondral हड्डी गठन के लिए योगदान कर सकता है। हालांकि वे कहते हैं कि विकास का प्रस्ताव प्लेट chondrocytes फैटी, immunohistochemical धुंधला के आधार पर अस्थिकोरक में transdifferentiate करने की क्षमता थी, और इन विट्रो में 46 अध्ययन, इन तरीकों में से कोई भी wअस्थिकोरक वंश को उपास्थिकोशिका योगदान के प्रदर्शन में निश्चित अरे।
सेल वंश अनुरेखण तकनीक सेल भाग्य का अध्ययन करने के लिए एक और अधिक कठोर हो गए हैं। संक्षेप में कहें, तो recombinase एंजाइम है, जो केवल सेल का एक विशिष्ट प्रकार में व्यक्त किया जाता है, रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है। इस रास्ते में, सेल के इस प्रकार के और उनके वंशजों को स्थायी रूप से चिह्नित कर रहे हैं 7। Cre पर loxP प्रणाली सामान्यतः वंश का पता लगाने में किया जाता है। Cre (recombinase एंजाइम) दो loxP साइटों के बीच रोकें अनुक्रम आबकारी एवं एक विशेष सेल लाइन (चित्रा 1 ए) में रिपोर्टर को सक्रिय करेंगे। कुछ मामलों में, अन्वेषक एस्ट्रोजन रिसेप्टर (सीआरई ERT2) 8 का एक संशोधित रूप को फ्यूज करने के लिए Cre के कारण इस तरह के tamoxifen के रूप में एक दवा का उपयोग करके Cre सक्रिय करने के लिए एक अनुकूल समय बिंदु का चयन कर सकते हैं। फ्लोरोसेंट संवाददाताओं प्रयोगों अनुरेखण क्योंकि वे नाटकीय रूप से जटिलता को कम वंश में मानक बन गए हैंऔर सटीकता और सेल भाग्य 8,9 ट्रेसिंग की दक्षता में सुधार होगा। tdTomato फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के बीच में सबसे अच्छा विकल्प बनने के बाद से यह प्रतिभाशाली फ्लोरोसेंट प्रोटीन और मजबूत epifluorescence है, जिससे यह आसानी से कल्पना 7 (चित्रा 1 ए) है।
Rosa26 tdTomato वंश अनुरेखण प्रणाली का उपयोग करके, हमारे समूह और अन्य जांचकर्ताओं से पता चला है कि एचसीएस विकास 10-14 के दौरान अस्थि कोशिकाओं में उनके phenotype बदल सकते हैं। 2.3Col1a1-GFP (अस्थिकोरक के लिए विशिष्ट) और immunofluorescence (अस्थि कोशिकाओं के लिए विशिष्ट): यह पूरा करने के लिए, हम Rosa26 tdTomato (सर्वव्यापक अभिव्यक्ति सभी कोशिकाओं में) / CRE (chondrocytes के लिए विशिष्ट) चूहों के साथ संयोजन ट्रेसिंग के दो सेट विकसित की है। डेटा दिखाना है कि दोनों तरीकों विवो में सेल भाग्य का अध्ययन करने के लिए व्यवहार्य तरीके हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
तकनीकी सीमाओं के कारण, यह हमेशा विवो में कोशिकाओं के व्यवहार की जांच के लिए मुश्किल है। हालांकि, सेल वंश अनुरेखण तकनीक कोशिका जीव विज्ञान 7-9 अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हो रही है। इस अ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
