Samlokalisering av Cell Lineage Markörer och tomat Signal
Summary
Vi utvecklade två uppsättningar spåra kombinationer i ROSA26 tdTomato (ubiquitously uttryckt i alla celler) / Cre (specifikt uttryckt i kondrocyter) möss: en med 2.3Col1a1-GFP (specifik för osteoblaster) och en med immunofluorescens (specifik för benceller). Data visar den direkta omvandlingen av kondrocyter i benceller.
Abstract
Cell härstamning spåra systemet har använts främst i utvecklingsbiologi studier. Användningen av Cre-rekombinas möjliggör aktivering av reportern i en specifik cellinje och all avkomma. Här har vi använt cell härstamning spåra teknik för att visa att kondrocyter direkt omvandlas till osteoblaster och osteocyter under lång ben och mandibulära Condyle utveckling med två typer av Cre, Col10a1-Cre och aggrekan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), korsas med ROSA26 tdTomato. Både Col10 och aggrekan är välkänd markörer för kondrocyter.
På grundval av detta har vi utvecklat en ny metod-cellinje spårning i samband med fluorescerande immunohistokemi till definiera cell öde genom att analysera uttrycket av specifika cellmarkörer. Runx2 (en markör för tidig fas osteogena celler) och Dentin matris protein1 (DMP1, en markör för sent stadium osteogena celler) varanvänds för att identifiera kondrocytceller härrörande benceller och deras differentieringsstatus. Denna kombination inte bara breddar tillämpningen av cellhärstamning spårning, utan förenklar även generering av sammansatta möss. Ännu viktigare är de antal, plats och differentierings status för modercellen avkomma visas samtidigt, vilket ger mer information än cellinje spåra ensam. Sammanfattningsvis är co-tillämpning av cell härstamning spåra tekniker och immunofluorescens ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellbiologi in vivo.
Introduction
Under utveckling står endokondral benbildning för över 80% av skelettet volym. Det anses allmänt att det börjar med apoptos av hypertrofiska kondrocyter. Därefter cellerna från den underliggande benmärgen invadera och initiera angiogenes, följt av nytt ben avsättning av ben marrow- och periosteum härledda celler 1,2. Cell öde hypertrofiska kondrocyter (HC), har dock varit en fråga för debatt för årtionden 3. Inledningsvis var HC anses vara slutet av chondrocyte differentieringsvägen, och apoptos i allmänhet tros vara den slutliga öde HC. Nu, vissa forskare tyder på att åtminstone en del HC kunde överleva och bidra till endokondral benbildning. Även om de föreslog att tillväxtplattan kondrocyter hade förmågan att transdifferentiera i osteoblaster baserade på ultra, immunhistokemisk färgning och in vitro studier 46, ingen av dessa metoder were slutgiltigt visa kondrocyter bidrag till osteoblast härstamning.
Cell härstamning spåra teknik ger en mer noggrant sätt att studera cell öde. I korthet, ett rekombinas enzym, som endast uttrycks i en viss typ av cell, stimulerar expression av rapportörgenen. På detta sätt är den här typen av cell och deras avkomlingar permanent märkt 7. Cre-loxP-systemet används ofta i härstamning spårning. Cre (rekombinaset enzym) kommer skära ut STOP-sekvensen mellan de två loxP-ställen och aktivera reportern i ett visst cellinje (Figur 1A). I vissa fall, kan undersökaren välja en gynnsam tidpunkt för att aktivera Cre genom att använda ett läkemedel, såsom tamoxifen, vilket orsakar Cre att smälta till en modifierad form av östrogenreceptorn (Cre ERT2) 8. Fluorescerande reportrar har blivit standard i härstamning spåra experiment eftersom de dramatiskt minska komplexitetenoch förbättra noggrannheten och effektiviteten av cell öde spårning 8,9. tdTomato blir det bästa valet bland fluorescerande reportrar, eftersom det har den ljusaste fluorescerande proteinet och den starkaste epifluorescence, vilket gör det enkelt visualiseras 7 (Figur 1A).
Genom att använda ROSA26 tdTomato härstamning system för spårning, har vår grupp och andra forskare visat att HC kan ändra sin fenotyp till benceller under utveckling 10-14. För att uppnå detta har vi utvecklat två uppsättningar spåra kombinationer med ROSA26 tdTomato (ubiquitous uttryck i alla celler) / Cre (specifikt för kondrocyter) möss: 2.3Col1a1-GFP (specifik för osteoblaster) och immunofluorescens (specifikt för benceller). Data visar att båda metoderna är viabla sätt att studera cellernas öde in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av tekniska begränsningar, är det alltid svårt att undersöka beteendet hos celler in vivo. Emellertid är cell härstamning spåra teknik visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att studera cellbiologi 7-9. I denna studie har vi ytterligare förbättra detta protokoll genom att kombinera den med immunofluorescens. På detta sätt kan cellöde definieras av flera relaterade markörer, vilket breddar tillämpningen av härstamning spårning. Dessutom har denna samlokalisering av immuno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
