Eksperimentel protokol til påvisning<em> Cyanobakterier</em> I flydende og faste Prøver med et antistof mikroarraychippen
Summary
The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.
Abstract
Global opvarmning og eutrofiering foretage nogle akvatiske økosystemer opfører sig som sande bioreaktorer, der udløser en hurtig og massiv cyanobakteriel vækst; dette har relevant sundhedsmæssige og økonomiske konsekvenser. Mange cyanobakterielle stammer er toksin producenter, og kun nogle få celler er nødvendige for at inducere uoprettelig skade på miljøet. Derfor vand-body myndigheder og forvaltninger kræver hurtige og effektive varslingssystemer, der leverer pålidelige data til at støtte deres forebyggende eller helbredende beslutninger. Dette manuskript rapporterer en forsøgsprotokol for i marken påvisning af toksin-producerende cyanobakterielle stammer ved anvendelse af et antistof microarray chip med 17-antistoffer (ABS) med taksonomiske opløsning (CYANOCHIP). Her en multiplex fluorescerende sandwich microarray immunassay (FSMI) til samtidig overvågning af 17 cyanobakterielle stammer ofte findes blomstrende i ferskvandsøkosystemer, nogle af dem toksin producenter, er beskrevet. En mikroarray med multipel identiske gentagelser (op til 24) af CYANOCHIP blev trykt på et enkelt objektglas til samtidig teste et lignende antal prøver. Flydende prøver kan testes enten ved direkte inkubering med antistoffer (Abs) eller efter cellekoncentration ved filtrering gennem en 1- til 3-um filter. Faste prøver, såsom sedimenter og jord klipper, først homogeniseres og dispergeres ved en håndholdt ultralydsapparat i en inkubationsbuffer. De er derefter filtreret (5 – 20 um) til fjernelse af groft materiale, og filtratet inkuberes med Abs. Immunreaktioner afsløres ved en endelig inkubation med en blanding af 17 fluorescens-mærkede Ab'er og læses af en bærbar fluorescensdetektor. Hele processen tager omkring 3 timer, det meste af det, der svarer til to 1-h perioder med inkubation. Outputtet er et billede, hvor lyspunkter svarer til den positive detektion af cyanobakterielle markører.
Introduction
Den afsløring og overvågning af mikroorganismer i komplekse naturlige mikrobielle samfund er afgørende i mange områder, herunder biomedicin, miljømæssig økologi, og astrobiologi. Cyanobakterier er prokaryote mikroorganismer velkendte for deres evne til at danne blomstrer (overdreven spredning) af celler i ferskvand. De er allestedsnærværende, og mange arter er i stand til at producere toksiner, hvilket ikke kun en potentiel risiko for menneskers sundhed, men også til en økologisk effekt. I denne forbindelse er det vigtigt at udvikle hurtige og følsomme metoder til tidlig påvisning af cyanobakterier og / eller deres toksiner i jord og vand. Til dette formål har en multiplex fluorescerende sandwich microarray immunassay (FSMI) er udviklet som et redskab til vand ledere til at hjælpe dem med at træffe beslutninger og dermed at gennemføre ordentlige vand management programmer.
En bred vifte af metoder er blevet udviklet til at opdage og identificere cyanobacterial celler og ALGEGIFT i jord og vand, herunder optisk mikroskopi, molekylær biologi, og immunologiske teknikker. Disse metoder kan variere meget i de oplysninger, de giver. Mikroskopiske teknikker er baseret på cellemorfologi og påvisning af in vivo-fluorescens fra cyanobakterielle pigmenter, såsom phycocyanin eller klorofyl a 1. Selv om de er hurtige og billige metoder til real-time og hyppig kontrol der informerer om typen og antallet af cyanobakterier til stede i en prøve, de ikke giver oplysninger om den potentielle toksicitet. Desuden kræver de en vis grad af ekspertise, i betragtning af at det ofte er meget svært at skelne mellem nært beslægtede arter 2. For at overvinde disse begrænsninger, skal lysmikroskopi ledsages af både biologiske og biokemiske screening assays og fysisk-kemiske metoder til identifikation og kvantificering af ALGEGIFT.
<pclass = "jove_content"> enzymmærket assays (ELISA), protein phosphat inhiberingsassays (PPIA), og neurokemiske forsøg i mus er eksempler på biokemiske screeningsassays til påvisning af ALGEGIFT. Mens de to første er hurtige og følsomme metoder, er blevet beskrevet falske positiver ved brug ELISA og PPIA tests er begrænset til tre typer af toksiner. Musen bioassay er en kvalitativ teknik med lav følsomhed og præcision, og særlig licenser og uddannelse er nødvendig. Hertil kommer, at det ikke giver oplysninger om den type af toksiner til stede i en prøve. ALGEGIFT kan identificeres og kvantificeres ved andre analytiske fremgangsmåder, såsom højtydende væskekromatografi (HPLC), væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), gaschromatografi (GC), gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), eller matrix-assisteret laser desorption / ionisering time of flight (MALDI-TOF). Men dette er kun muligt, hvis referencestandarder, der er brug fored at fastsætte individuelle koncentrationer toksin i komplekse prøver, er til rådighed 3, 4. Desuden er disse metoder er tidskrævende; kræver dyrt udstyr, forsyninger og prøveforberedelse; og skal udføres af erfarne og specialiserede medarbejdere.Er blevet anvendt Molekylære-baserede metoder i årtier at påvise, identificere og kvantificere cyanobakterier og deres tilsvarende ALGEGIFT takket være de oplysninger sekvens offentliggjort i genomdatabaser (fx National Center for Biotechnology Information, NCBI). Blandt disse metoder er sådanne baseret på polymerasekædereaktion (PCR), hvori der kræves udformning af sæt af primere for DNA-amplifikation og afhænger af forudgående kendskab til DNA-sekvenser af forskellige cyanobakterielle arter. Mens gen afsløring, ligesom phycocyanin operon, fører til præcis identifikation på slægten niveau, nogle arter eller stammer er uopdaget meddenne metode. Men toksin gener, såsom dem, der tilhører den microcystin operon, lette identifikationen af toksiner i prøver, hvor producenterne er knappe 5. Alligevel gør påvisningen af toksin markører ved PCR ikke nødvendigvis toksicitet i miljøet. Desuden sæt primere, der er udviklet til at analysere hele spektret af arter af cyanobakterier og toksinvåben producenter til stede i en prøve er stadig ufuldstændig, og yderligere undersøgelser skal gøres for at identificere ukendte arter. Andre molekylære teknikker er ikke-PCR-baseret, såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH) og DNA microarrays.
I de sidste to årtier har microarray teknologi fået større betydning i mange anvendelsesområder, især i miljøovervågning. Mikromatrice mulighed for forskelsbehandling mellem arter og analytter 4, 6, 7 </sup>, 8, 9, 10, men de betragtes meget omstændelig og tidskrævende opgaver, der involverer flere trin (f.eks microarray ydeevne, DNA ekstraktion, PCR-amplifikation og hybridisering). Af denne grund, mindre tidskrævende assays baseret på antistoffer, såsom sandwich og konkurrencedygtige immunologiske mikroarrays, er blevet et vigtigt og pålidelig høj kapacitet til påvisning af multiple miljømæssige analytter 11, 12, 13. Evnen af antistoffer til specifikt at genkende deres målforbindelser og at detektere små mængder af analytter og proteiner, sammen med muligheden for at fremstille antistoffer mod næsten ethvert stof, gør antistof-mikroarrays en kraftfuld teknik til miljømæssige formål. Desuden evnen til at opnå multiple analyser somIngle assay med detektionsgrænser spænder fra ppb til PPM, er en af de vigtigste fordele ved denne metode 14.
Antistofbaserede biosensorer har vist sig at være følsomme og hurtige værktøjer til påvisning af en lang række patogener og toksiner i miljøovervågning 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Mens DNA-metoder involverer flere trin, kun de antistof-baserede mikroarrays kræver en lille prøve forberedelse, der primært er baseret på en kort lyse skridt i en passende løsning buffer. Delehanty og Ligler 15 rapporterede samtidig påvisning af proteiner og bakterielle analytter i komplekse blandinger på basis af et antistof sandwich immunoassay stand til at detektere en proteinkoncentration på 4 ppb end 10 4 cfu / ml celler. Szkola et al. 21 har udviklet en billig og pålidelig multiplex microarray til samtidig påvisning af proteotoxins og små toksiner, forbindelser, der kan anvendes i biologisk krigsførelse. De opdages koncentrationer af ricin toksin, med en detektionsgrænse på 3 ppb, på mindre end 20 min. For nylig er CYANOCHIP, et antistof microarray-baseret biosensor til in situ detektion af giftige og ikke-toksisk cyanobakterier, blevet beskrevet 22. Denne microarray muliggør identifikation af potentielle cyanobakterielle blooms, mest i vandmiljøer, som er vanskelige at identificere mikroskopisk. Detektionsgrænsen af microarray er 10 Marts 2-10 celler for de fleste arter, dreje denne biosensor til et omkostningseffektivt redskab til multiplex detektion og identifikation af cyanobakterier, selv på artsniveau. Alle disse egenskaber gør Antibody microarray teknik, og især den fremgangsmåde præsenteres i dette arbejde, en hurtigere og enklere metode i forhold til de førnævnte teknikker.
Dette arbejde viser to eksempler på forsøg, der anvender et antistof microarray-baseret biosensor til påvisning af tilstedeværelsen af cyanobakterier i jord- og vandprøver. Det er en enkel og pålidelig metode baseret på en sandwich immunoassay format, som kræver meget små prøvevolumener og meget grundlæggende prøveforberedelse. Metoden kræver en kort tid og kan let udføres i marken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her er en multiplex fluorescerende sandwich immunassay med anvendelse af CYANOCHIP, en 17-antistof microarray til påvisning og identifikation af en bred vifte af cyanobakteriel slægter, beskrevet 22. Disse cyanobakterier udgør den hyppigste bentiske og planktoniske slægter i ferskvandsområder, nogle af dem er toksin producenter. For nylig er det fluorescerende sandwich-immunassay-format blevet anvendt til at identificere mikroorganismer og / eller bioanalytes i miljømæssige anvend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Antonio Quesada fra Universidad Autónoma de Madrid for at give cyanobakterielle stammer. Dette arbejde blev finansieret af Subdirección General de Proyectos de Investigación for det spanske Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), giver ingen. AYA2011-24803 og ESP2014-58494-R.
Materials
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X) | Thermofisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2X | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0,5 ml tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10-12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
- Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
- Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
- Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
- Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
- Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
- Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
- Kegel, J. U., Del Amo, ., Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
- Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
- Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
- Parro, V. . Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 2699-2710 (2010).
- Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
- Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
- Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
- Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
- Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
- Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
- Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
- Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
- Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre, ., Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
- Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
- Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
- Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
- McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).
