Abstract
ظاهرة الاحتباس الحراري وزيادة المغذيات جعل بعض النظم الإيكولوجية المائية تتصرف المفاعلات الحيوية الحقيقية كما أن يؤدي النمو السيانوبكتيريا السريع والهائل. هذا له الصحية ذات الصلة والعواقب الاقتصادية. العديد من السلالات السيانوبكتيريا والمنتجين السم، وفقط عدد قليل من الخلايا اللازمة للحث على ضرر لا يمكن إصلاحه للبيئة. لذلك، السلطات مائي والإدارات تتطلب نظم الإنذار المبكر السريعة والفعالة وتوفير بيانات موثوقة لدعم القرارات الوقائية أو العلاجية الخاصة بهم. تقارير هذه المخطوطة بروتوكول تجريبي للكشف في مجال سلالات السيانوبكتيريا المنتجة للسموم باستخدام ميكروأري رقاقة الأجسام المضادة مع الأجسام المضادة 17 (عبس) لقرار التصنيفية (CYANOCHIP). هنا، وتعدد الإرسال الفلورسنت المناعية شطيرة ميكروأري (FSMI) لرصد وقت واحد من 17 سلالات السيانوبكتيريا في كثير من الأحيان وجدت تزهر في النظم الإيكولوجية للمياه العذبة، وبعضهم من المنتجين السم، وصفت. وميكروأري مع متعددةسبيل مكررات متطابقة (تصل إلى 24) من CYANOCHIP طبعت على شريحة المجهر واحدة لاختبار في وقت واحد عددا مماثلا من العينات. العينات السائلة يمكن اختبارها إما عن طريق حضانة مباشرة مع الأجسام المضادة (عبس) أو بعد تركيز خلية عن طريق الترشيح من خلال مرشح 1- إلى 3 ميكرون. العينات الصلبة، مثل الرواسب والصخور الأرض، ويتجانس الخليط الأول وفرقت من قبل ultrasonicator باليد في وجود مخزن مؤقت الحضانة. ثم يتم تصفيتها (5-20 ميكرون) لإزالة المواد الخشنة، وحضنت الترشيح مع القيمة المطلقة. وكشف Immunoreactions من قبل حضانة النهائية مع خليط من القيمة المطلقة مضان المسمى 17 ويتم قراءتها بواسطة جهاز الكشف عن مضان المحمولة. العملية كلها تستغرق حوالي 3 ساعات، أكثر من ذلك المقابلة لفترتين 1-ساعة من الحضانة. الإخراج هو صورة، حيث تتوافق النقاط المضيئة لكشف إيجابي من علامات السيانوبكتيريا.
Introduction
كشف ورصد الكائنات الحية الدقيقة في المجتمعات الميكروبية الطبيعية المعقدة حاسمة في العديد من المجالات، بما في ذلك الطب الحيوي والبيئة البيئية، والبيولوجيا الفلكية. البكتيريا الزرقاء هي الكائنات الحية الدقيقة بدائية النواة المعروفة لقدرتها على تشكيل تزهر (الانتشار المفرط) من الخلايا في المياه العذبة. انهم في كل مكان، والعديد من الأنواع قادرة على إنتاج السموم، مما يؤدي ليس فقط إلى خطر محتمل على صحة الإنسان، ولكن أيضا إلى التأثير البيئي. وفي هذا الصدد، لا بد من تطوير أساليب سريعة وحساسة للكشف المبكر من البكتيريا الزرقاء و / أو سمومها في التربة والمياه. لهذا الغرض، تم تطوير تعدد الإرسال الفلورسنت المناعية شطيرة ميكروأري (FSMI) كأداة لإدارة المياه لمساعدتهم في اتخاذ القرارات، وبالتالي، في تنفيذ البرامج المناسبة لإدارة المياه.
وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لاكتشاف وتحديد السماويخلايا obacterial وcyanotoxins في التربة والمياه، بما في ذلك المجهر الضوئي، والبيولوجيا الجزيئية، والتقنيات المناعية. هذه الأساليب يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في المعلومات التي يقدمونها. وتعتمد التقنيات المجهرية على شكل الخلية وكشف في الجسم الحي مضان من الأصباغ السيانوبكتيريا، مثل فيكوسيانين أو الكلوروفيل (أ) 1. على الرغم من أنها طرق سريعة ورخيصة في الوقت الحقيقي والرصد المتكرر لإعلام حول نوع وعدد من البكتيريا الزرقاء الموجودة في عينة، فإنها لا تعطي معلومات حول السمية المحتملة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تتطلب مستوى معين من الخبرة، معتبرا أنه غالبا ما يكون من الصعب جدا التمييز بين الأنواع ذات صلة وثيقة 2. للتغلب على هذه القيود، يجب أن يصاحب ضوء المجهر من قبل كل من فحوصات الكشف البيولوجية والكيميائية الحيوية والطرق الفيزيائية لتحديد وتقدير من cyanotoxins.
طبقت على أساس أساليب الجزيئية لعقود من الزمن لكشف وتحديد، وتحديد البكتيريا الزرقاء وcyanotoxins المقابلة شكرهم للمعلومات تسلسل نشرت في قواعد بيانات الجينوم (على سبيل المثال، المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية، NCBI). ومن بين هذه الطرق هي تلك التي تستند إلى تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، الأمر الذي يتطلب تصميم مجموعات من الاشعال لتضخيم الحمض النووي وتعتمد على معرفة سابقة من تسلسل الحمض النووي من الأنواع السيانوبكتيريا مختلفة. في حين كشف الجينات مثل الاوبرون فيكوسيانين، يؤدي إلى تحديد دقيق على مستوى جنس، فإن بعض الأنواع أو السلالات هي التي لم يتم كشفها معهذه الطريقة. ومع ذلك، جينات ترميز السم، مثل أولئك الذين ينتمون إلى الاوبرون microcystin، تسهيل التعرف على السموم في العينات حيث المنتجين شحيحة 5. ومع ذلك، والكشف عن علامات السمية عن طريق PCR لا يعني بالضرورة سمية في البيئة. وعلاوة على ذلك، فإن مجموعة من الاشعال المتقدمة لتحليل مجموعة كاملة من الأنواع من البكتيريا الزرقاء والسمية المنتجين الحالي في عينة لا يزال غير مكتمل، ويجب أن يتم إجراء المزيد من الدراسات لتحديد أنواع غير معروفة. وغير PCR القائم على التقنيات الجزيئية الأخرى، مثل مضان في الموقع التهجين (FISH) وميكروأرس الحمض النووي.
في العقدين الأخيرين، وقد اكتسبت أهمية تكنولوجيا متطورة في العديد من مجالات التطبيق، لا سيما في مجال الرصد البيئي. ميكروأرس الحمض النووي تسمح للتمييز بين الأنواع والتحاليل 4، 6، 7 سوب>، 8، 9، 10، لكنها نظرت الى شاقة للغاية والمهام التي تنطوي على خطوات متعددة (على سبيل المثال، أداء ميكروأري، واستخراج الحمض النووي، PCR التضخيم، والتهجين) تستغرق وقتا طويلا. لهذا السبب، وأقل فحوصات تستغرق وقتا طويلا بناء على الأجسام المضادة، مثل شطيرة وميكروأرس المناعية تنافسية، وأصبحت وسيلة عالية الإنتاجية أساسي وموثوق بها للكشف عن التحاليل البيئية متعددة 11 و 12 و 13. قدرة الأجسام المضادة لتسلم على وجه المركبات المستهدفة وللكشف عن كميات صغيرة من التحاليل والبروتينات، جنبا إلى جنب مع إمكانية إنتاج الأجسام المضادة ضد مادة تقريبا أي، وجعل المجهرية الضد تقنية قوية للأغراض البيئية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على تحقيق متعددة تحلل في مثلإنجل الفحص، مع حدود الكشف بدءا من جزء في البليون إلى PPM، هو واحد من أهم مزايا هذه الطريقة 14.
وقد أثبتت أجهزة الاستشعار القائمة على أجسام مضادة لتكون أدوات حساسة وسريعة للكشف عن مجموعة واسعة من مسببات الأمراض والسموم في الرصد البيئي 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21. بينما الأساليب الحمض النووي تنطوي على عدة خطوات، وميكروأرس القائم على الأجسام المضادة لا تتطلب سوى تحضير عينة صغيرة التي تقوم أساسا على خطوة تحلل قصيرة في وجود مخزن مؤقت الحل المناسب. ذكرت Delehanty وLigler 15 كشف في وقت واحد من البروتينات والتحاليل البكتيرية في مخاليط معقدة على أساس المناعي الأجسام المضادة شطيرة قادرة على الكشف عن تركيز البروتين من 4 جزء في البليوند 10 4 كفو / مل من الخلايا. SZKOLA وآخرون. وقد وضعت 21 ميكروأري متعدد رخيصة ويمكن الاعتماد عليه للكشف في وقت واحد proteotoxins والسموم صغيرة، ومركبات التي يمكن استخدامها في الحرب البيولوجية. أنها اكتشفت تركيزات من مادة الريسين السامة، مع الحد من الكشف عن 3 أجزاء من البليون، في أقل من 20 دقيقة. في الآونة الأخيرة، فقد وصفت CYANOCHIP، وهو جهاز الاستشعار البيولوجي استنادا ميكروأري الأجسام المضادة للفي الموقع كشف عن البكتيريا الزرقاء السامة وغير سام، 22. هذا ميكروأري يسمح لتحديد تزهر السيانوبكتيريا المحتملة، ومعظمها في البيئات المائية، التي يصعب تحديد مجهريا. الحد من الكشف عن ميكروأري هو 10 فبراير - 10 مارس خلايا لمعظم الأنواع، وتحول هذا جهاز الاستشعار البيولوجي إلى أداة فعالة من حيث التكلفة للكشف عن تعدد الإرسال وتحديد البكتيريا الزرقاء، حتى على مستوى الأنواع. كل هذه المواصفات تجعل من antiboتقنية ميكروأري دى، وخاصة الطريقة المعروضة في هذا العمل، وهي طريقة أسرع وأبسط مقارنة مع التقنيات المذكورة أعلاه.
يعرض هذا العمل مثالين من التجارب التي تستخدم الأجسام المضادة جهاز الاستشعار البيولوجي القائم على ميكروأري للكشف عن وجود البكتيريا الزرقاء في عينات من التربة والمياه. وهي طريقة بسيطة وموثوق بها على أساس شكل المناعية شطيرة التي تتطلب كميات عينة صغيرة جدا وإعداد نموذج بسيط للغاية. وتتطلب هذه الطريقة وقت قصير ويمكن أن يؤديها بسهولة في هذا المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد Immunogens
- تنمو كل سلالة السيانوبكتيريا في مستنبت مماثل تحت الشروط الموضحة في الجدول 1.
وترد متوسطة النمو والثقافة الشروط لكل سلالة البكتيريا الزرقاء في الجدول رقم 1: ملاحظة. كل السلالات السيانوبكتيريا، باستثناء K17، تنتمي إلى مجموعة أنطونيو كيسادا من جامعة المستقلة (مدريد، اسبانيا). تم إنشاء الأجسام المضادة ضد rubescens Planktothrix من عينة الطبيعية للازهر أحادي النوعية من هذا cyanobacterium من Vilasouto خزان (شمال اسبانيا). - تحديد عدد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا بواسطة المجهر الضوئي للحصول على ما يقرب من 10 8 خلايا / مل من ثقافة مرحلة النمو الأسي أو ثابتة في وقت متأخر.
- حصاد الخلايا من 5 مل من الثقافة بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
- تجاهل وطاف resuspend الخلايا في حوض 10 مله مع 5 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني 1X) للحصول على حوالي 10 8 خلايا / مل.
- التجانس وليز خلايا التعليق من صوتنة لمدة 5 دورات، 30 ثانية لكل منهما، مع 30- 60-ق وقفة على الجليد، وذلك باستخدام المحمولة، باليد المعالج بالموجات فوق الصوتية أو عن طريق غمس الأنبوب في حمام مائي ل اختلال الخلية في أقصى سعة (30 كيلو هرتز).
- كرر الخطوات من 1،3-1،5 لكل سلالة من cyanobacterium.
ملاحظة: صوتنة تنتج تمزق خلية وإطلاق المحتوى الخلوي. بينما البروتينات والسكريات هي immunogens جيدة، جزيئات محددة، مثل الدهون والأحماض النووية، لا تحفز على الاستجابة المناعية الخلطية من تلقاء انفسهم. لذلك، يجب أن ربط شركات، مثل السكريات أو البروتينات، لزيادة تعقيد الجزيئي. وبالإضافة إلى ذلك، صوتنة النشرات المواد داخل الخلية والذي يمكن أن يؤدي الى انتاج الأجسام المضادة.
2. إنتاج الأجسام المضادة بولكلونل
- إعداد IMM الأولجرعة unogen عن طريق خلط 0.5 مل من المحللة خلية ultrasonicated حصلت عليه في الخطوة 1.5 مع 0.5 مل من مساعد الكامل فرويند. إيصالها إلى مشغل منشأة الحيوانية لبولكلونل إنتاج الأرانب الأجسام المضادة.
- إعداد ثلاث جرعات أكثر كما كان من قبل لاستخدامها مرة أخرى كما يعزز الذاكرة في عملية إنتاج الأجسام المضادة عن طريق خلط 0.5 مل من جناسة نفسه / المحللة حصلت عليه في الخطوة 1.5 مع 0.5 مل من مساعد ناقصة فرويند. تعطيها للمنشأة الحيوانية لتحقيق عملية إنتاج الأجسام المضادة.
- كرر الخطوات من 2.1 و 2.2 لكل عملية إنتاج الأجسام المضادة الجديدة.
ملاحظة: عادة، ويعهد إنتاج الأجسام المضادة لمرافق الحيوان المتخصصة أو الشركات، لأن المطلوب الترخيص والتدريب المناسب للعمل مع الحيوانات. شركات توريد انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) قياس النسبي لكمية من الأجسام المضادة مستضد معين الموجودة في عينة الدم.
3. الجسم المضاد Purification
- تنقية المناعي G (مفتش) جزء من كل من المناعة والمصل قبل المناعة التي تم جمعها في الخطوة 2 من البروتين واللوني التقارب. بعض مجموعات تنقية التجارية، على أساس أنظمة خرطوشة، تعمل بشكل جيد. اتبع تعليمات مقدم.
- عندما لا عدة تنقية توفير نظام تحلية، تغيير المخزن المؤقت بعد شطف من الأجسام المضادة النقاء إلى 0.1X برنامج تلفزيوني، إما عن طريق الغسيل الكلوي أو باستخدام أجهزة الطرد المركزي تصفية مع 100 كيلو دالتون (أو أقل) حجم مسام الغشاء.
- تحديد تركيز الأجسام المضادة عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر أو باستخدام الأساليب اللونية، مثل برادفورد 23، لوري 24، أو حمض Bicinchoninic (BCA) 25.
ملاحظة: من المهم تجنب بما في ذلك المجموعات أمين في شطف العازلة (على سبيل المثال، ومخازن تريس) لأنها تتنافس مع الأجسام المضادة للربط على الأسطح الصلبة تفعيلها مع مجموعة الايبوكسي. بعد بوrification، فمن المهم لاختبار النشاط الضد مع إليسا.
4. الإسفار الأجسام المضادة وصفها
- تسمية الأضداد النقية التي تم الحصول عليها في القسم 3 مع تألقي (على سبيل المثال، صبغة الفلورسنت بعيدة الحمراء) عن طريق إذابة قارورة التجارية التي تحتوي على صبغة لوضع العلامات 1 ملغ من البروتين في 100 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]). إضافة 2 ميكرولتر من صبغ حل لكل إعداد الأجسام المضادة بتركيز 2 ملغ / مل في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر في 50 ملي المالحة الفوسفات مخزنة (الرقم الهيدروجيني 8.5).
- الحفاظ على ردود الفعل وصفها في إطار التحريض المستمر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة و 1،200 دورة في الدقيقة على منصة تهتز.
- تنقية الأجسام المضادة المسمى حسب الحجم الاستبعاد اللوني (على سبيل المثال، وذلك باستخدام هلام مع مجموعة التجزئة ما بين 1.5 و 30 كيلو دالتون المحاصرين في عمود)، بناء على توصيات المورد.
- قياس الامتصاصية في 280 نانومتر و 650 نانومتر في في eluates وحساب العلامهالكفاءة ينغ بناء على توصيات المورد.
ملاحظة: ما يصل إلى 50 × 50 ميكرولتر يمكن القيام به ردود فعل الأجسام المضادة وضع العلامات مع قنينة واحدة من صبغة الفلورسنت لوصفها 1 ملغ من البروتين. فمن المستحسن لتغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم أو، بدلا من ذلك، لاستخدام مبهمة أنابيب 0.5 مل لتجنب عمليات التبريد بعد خطوة 4.3. لالأجسام المضادة، ويتحقق وضع العلامات الأمثل مع 3-7 مول للصباغة في مول من الأجسام المضادة.
الإنتاج 5. CYANOCHIP
- الأجسام المضادة والضوابط في حل الطباعة
- إعداد 30 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة النقي في حل الطباعة عن طريق خلط كل الأجسام المضادة في 1 ملغ / مل في منطقة عازلة الطباعة البروتين 1X التجاري مع 0.01٪ (ت / ت) توين 20 (أ المنظفات غير الأيونية)، كل ذلك تركيزات النهائي.
ملاحظة: بدلا من ذلك، قد تحتوي على حل الأجسام المضادة 20٪ الجلسرين، 1٪ (ث / ت) والسكروز (أو طرهالوز، كمادة حافظة)، و 0.01٪ (ت / ت) توين 20 في المخزن كربونات (درجة الحموضة 8.5). - إعداد 30 ميكرولتر من الحل الطباعة والضوابط: (أ) عازلة الطباعة 1X البروتين مع 0.01٪ (ت / ت) توين 20، (ب) من البروتين مصل قبل المناعة النقي في 1 ملغ / مل في 1X عازلة الطباعة البروتين مع 0.01٪ (ت / ت) توين 20، و (ج) زلال المصل البقري (BSA) في 1 ملغ / مل في 1X عازلة الطباعة البروتين مع 0.01٪ (ت / ت) توين 20.
- إعداد 30 ميكرولتر من ذلك، تنقية الدم قبل المناعة fluorescently المسمى بتركيزات مختلفة (على سبيل المثال، من 50 ميكروغرام / مل إلى 1 ميكروغرام / مل) في 1X عازلة الطباعة البروتين مع توين 20، كما في الخطوة 5.1.1. وسوف تستخدم هذه العينات كعلامات إطار الفلورسنت والكمي مضان النسبي بعد اكتشاف.
- إضافة 30 ميكرولتر لكل بئر من حلول الطباعة أعد الخطوات 5.1.1، 5.1.2، 5.1.3 وعلى أعلى جودة 384 جيدا microplates لتصنيع ميكروأري، مثل البولي بروبلين.
ملاحظة: عازلة الطباعة البروتين يزيد من جودة واستقرار الأجسام المضادة، وتوين 20 تجانس بقعة موrphology ويبني البروتين اقتران تصل. فمن المستحسن للحفاظ على صفيحة 384 جيدا في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. تخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن. مادة البولي بروبيلين لديها الحمض النووي منخفضة، والبروتين، واستخراج الخلايا، وجزيء صغير ملزم جوهري.
- إعداد 30 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة النقي في حل الطباعة عن طريق خلط كل الأجسام المضادة في 1 ملغ / مل في منطقة عازلة الطباعة البروتين 1X التجاري مع 0.01٪ (ت / ت) توين 20 (أ المنظفات غير الأيونية)، كل ذلك تركيزات النهائي.
- طباعة الأجسام المضادة على شريحة المجهر
ملاحظة: طباعة الأجسام المضادة على الشرائح المجهر تفعيلها باستخدام منصات مجموعة مختلفة، مثل الاتصال، وانقسام إبرة، أو أجهزة عدم الاتصال، مثل الطابعات كهرضغطية أو تقنيات "الحبر النفاث". في هذا العمل، وCYANOCHIP وقد طبع بشكل روتيني عن طريق الاتصال باستخدام النظام الآلي (arrayer) قادرة على اكتشاف كميات NL من الأجسام المضادة في نطاق ميكرون.- تهيئة الظروف البيئية للغرفة الطباعة إلى 20 درجة مئوية و 40 - الرطوبة النسبية 50٪.
- إعداد ركائز الشرائح (على سبيل المثال، 75- × 25 ملم الشرائح تنشيط الايبوكسي ميكروسكوب) لأداء عدة متطابقة الأذربيجانية الأجسام المضادةيس على كل شريحة.
- اكتشاف كل الأجسام المضادة النقي، بما في ذلك الضوابط والإطار المرجعي، في نمط بقعة ثلاث نسخ. في ظل هذه الظروف، والبقع هي 180-200 ميكرون في القطر.
- بعد الطباعة، وترك الشرائح لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة الحرارة المحيطة السماح لهم الجافة، ومن ثم تخزينها في 4 درجات مئوية. للعمل في هذا المجال، الشرائح يمكن نقلها وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
ملاحظة: يتم طباعة CYANOCHIP في شكل ميكروأري بقعة ثلاث نسخ مع 3 × 8 ميكروأرس متطابقة لكل شريحة أو 9 صفائف متطابقة في شكل ميكروأري 1 × 9. لا يجب أن يكون حجم كل مجموعة أعلى من أبعاد دائرة رد الفعل لطوقا 24-جيدا (عادة 7.5 × 6.5 مم في غرفة التهجين 3 × 8). - قبل استخدام ميكروأري لتحليل العينات البيئية، واستخدام FSMI لتحديد تخفيف العمل لكل الأجسام المضادة في منحنى المعايرة. لكل الأجسام المضادة، واستخدام تركيز المعياري للIMM المقابلةunogen (10 مارس - 10 أبريل خلية / مل) والتخفيفات المسلسل من الأجسام المضادة فلوري (بين 1: 500 و 1: 32000). تركيز الأجسام المضادة الأمثل يتوافق مع 50٪ من الحد الأقصى لكثافة إشارة تم الحصول عليها في منحنى المعايرة. أيضا، لا بد من تحديد حساسية وخصوصية لكل الأجسام المضادة، كما هو موضح في بلانكو وآخرون. 22.
6. إعداد Multianalyte مقتطفات البيئي للمناعية الفلورسنت ساندويتش ميكروأري (FSMI)
- استخراج Multianalyte من عينة السائل
- خذ 1-100 مل من عينة السائل مع محقنة معقمة (على سبيل المثال، الماء من الشاطئ من خزان المياه)؛ كمية من العينة يعتمد إلى حد كبير على تركيز المحتمل للأهداف.
- تركيز الخلايا عن طريق تمرير عينة المياه من خلال حجم المسام 3 ميكرون، 47 ملم مرشح قطر البولي. تركيز الخلويةبين 10 مارس - 10 أغسطس خلية / مل من المرغوب فيه للكشف إيجابي، ولكن التركيز الحقيقي غير معروف.
- استرداد الكتلة الحيوية التي تم جمعها في تصفية مع 1 مل من مخزنة المالحة تريس المعدلة العازلة توين 20 عزز (TBSTRR؛ 0.4 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8)، 0.3 M كلوريد الصوديوم، و 0.1٪ توين 20) عن طريق كشط مع ملعقة في أنبوب 15 مل.
- التجانس وتفصيل باستخدام المعالج بالموجات فوق الصوتية المحمولة باليد، كما هو موضح في الخطوة 1.5، أو فقط من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. هذا يعد عينة لتحليلها من قبل ميكروأري.
- استخراج Multianalyte من العينة الصلبة
- يصل وزنه إلى 0.5 غرام من العينة الصلبة (مثل الصخور والتربة، والرواسب) في أنبوب 10 مل وتضيف ما يصل إلى 2 مل من TBSTRR.
- يصوتن بغمر التحقيق sonicator في الأنبوب، عن طريق غمس الأنبوب في حمام مائي لsonicator القرن قوية، أو باستخدام sonicator باليد. أداء لا يقل عن 5 × 30-قدورات في 30 كيلوهرتز، ووقف لمدة 30 ثانية في حين على الجليد.
- تصفية لإزالة الرمال والطين، وغيرها من المواد الخشنة مع حقنة 10 مل بالإضافة إلى قطر 10- إلى 12 ملم، 5- إلى 20 ميكرون حامل حجم المسام مرشح من النايلون. دفع عينة من خلال مرشح في أنبوب 1.5 مل. إذا كان يشبع التصفية، تستنهض الهمم معلق في حقنة وأخذه إلى واحد جديد. هذا وتعد المواد الترشيح لالمناعية (الخطوة 7).
ملاحظة: سعة التخزين المؤقت من TBSTRR تعتمد على نوع العينة. ومن المهم لتنفيذ المناعية على الفور بعد إعداد مستخلص البيئي لتجنب تأثير تدهور الأنزيمية على التحاليل. بدلا من ذلك، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني في استخراج البيئي وتجميد في -80 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.
7. الفلورسنت ساندويتش ميكروأري المناعية (FSMI)
- منع CYANOCHIP
ملاحظة: مباشرة قبل الاستعمال، علاج عrinted الشرائح لمنع جميع الفئات الايبوكسي مجانا على الشريحة ولإزالة الفائض من الأجسام المضادة ملزمة غير تساهمي.- تزج ميكروأري إلى 0.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 9) مع 5٪ (ث ت /) حل جيش صرب البوسنة على سطح نظيف (على سبيل المثال، طبق بيتري أو أنبوب 50 مل) مع الانفعالات خفيفة من منصة الروك لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، وضع الانزلاق في الصعود إلى 100- 200 ميكرولتر قطرة من حل أعلاه مع البقع ميكروأري التي تواجهها. يترك لمدة 3-5 دقائق ثم المضي قدما.
- اختيار بعناية الشريحة باستخدام الملقط ذات الرؤوس البلاستيكية. في محاولة لتجنب المناطق ميكروأري مؤثرة. القضاء على الفائض من السوائل عن طريق ضرب بهدوء الشريحة على منشفة ورقية. تزج به في 0.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8) مع 2٪ (ث / ت) حل جيش صرب البوسنة لمدة 30 دقيقة مع الإثارة خفيفة من منصة الروك.
- تجف الشريحة عن طريق إجراء الطرد المركزي القصير (200-300 x ج لمدة 1 دقيقة) باستخدام microcentrifuge لالتجارية تكييفها لشرائح المجهر. بدلا من ذلك، تجف الشريحة عن طريق ضرب بهدوء ونطالزراعة العضوية منشفة ورقية.
- حضانة استخراج عينة multianalyte مع ميكروأري
- إعداد شريحة في كاسيت ميكروأري التهجين التجاري مع 24 بئرا لميكروأرس متعددة؛ اتبع تعليمات مقدم.
- بعد الشريحة وكاسيت التجمع، ماصة تصل إلى 50 ميكرولتر من استخراج عينة أو التخفيف منه في TBSTRR في كل بئر من الكاسيت.
- كرر الخطوة 7.2.2 لكل عينة لتحليلها.
- كعنصر تحكم فارغة، ماصة 50 ميكرولتر من TBSTRR العازلة في اثنين على الأقل من آبار منفصلة من الكاسيت.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع خلط من قبل pipetting كل 15 دقيقة أو تركها تحت اهتزاز خفيف. بدلا من ذلك، واحتضان لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: استخدام الحشوات حضانة أخرى بوصفها وظيفة من نمط ميكروأري. الوقت ودرجة الحرارة للحضانة في الخطوة 7.2.5 معلمات التجريبية التي تعتمد عادة على تقارب وكي ملزمةnetics كل ازواج مستضد الضد.
- غسل
- إزالة عينات من خلال وضع شريط أسفل وبعناية يطرق على ورقة نظيفة، ماصة.
- غسل الآبار وذلك بإضافة 150 ميكرولتر من TBSTRR إلى كل واحد، والقضاء على المخزن المؤقت، على النحو الوارد أعلاه.
- كرر الخطوة 7.3.2 ثلاث مرات أكثر.
- الحضانة مع الأجسام المضادة للكشف الفلورسنت
- إضافة 50 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة التي تحتوي على 17 أضداد السيانوبكتيريا سلالة، كل المسمى مع تألقي في TBSTRR مع 1٪ (ث / ت) BSA. تحديد تركيز كل الأجسام المضادة فلوري في خليط (0،7-2 ميكروغرام / مل) عن طريق إجراء التجارب المعايرة من كل زوج مستضد / الأجسام المضادة 22.
- احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، كما هو موضح في الخطوة 7.2.5، أو لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- غسل من الأجسام المضادة الفلورسنت </ قوي>
- إزالة الأجسام المضادة غير منضم الفلورسنت، كما في الخطوة 7.3.
- تفكيك كاسيت وتزج الشريحة إلى 0.1X برنامج تلفزيوني (على سبيل المثال، في أنبوب 50 مل) لشطف سريع.
- تجف الشريحة كما في الخطوة 7.1.3.
8. الضوئي لالإسفار
- فحص شريحة لمضان في أقصى ذروة مضان الانبعاثات لصبغة الفلورسنت بعيدة الحمراء في الماسح الضوئي لمضان. أخذ عدة صور من المجهرية في المعلمات مسح مختلفة، عموما عن طريق خفض قيمة كسب الليزر.
ملاحظة: تجنب البقع المشبعة (> 65،000 التهم مضان) -أنهم خارج نطاق وقد إدخال أخطاء القياس الكمي.
9. معالجة الصور وتحليل البيانات
- استخدام البرمجيات التجارية لتحليل الصور وتقدير. يوفر البرنامج قياسات كثافة مضان (FI، متوسط أو متوسط كل بكسل من بقعة واحدة) للبريدبقعة منظمة العمل ضد الجوع من ميكروأري كله. طرح الخلفية المحلية في جميع أنحاء المناطق: FI = FI البقعة - FI خلفية المحلية.
- حفظ البيانات FI وفتحها باستخدام برنامج جدول بيانات.
- استخدام القيم التي تم الحصول عليها لصفائف فارغة كما سيطرة سلبية لتحديد والتخلص من ايجابيات كاذبة. تطبيق المعادلة التالية لحساب FI لكل بقعة الأجسام المضادة: FI = (FI عينة - FI فارغة)، حيث FI عينة = FI البقعة - تشغيل FI خلفية المحلية في المجهرية مع مقتطفات عينة وFI فارغة = بقعة FI - FI خلفية المحلية في ميكروأرس فارغة.
- تطبيق عتبة قطع إضافية من 2- 3 أضعاف متوسط FI من ميكروأري كله لتقليل احتمال من ايجابيات كاذبة. هذا مهم بشكل خاص للصور ميكروأري ذات نوعية رديئة، وانخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء.
- خلق المؤامرات و / أو تنفيذ مزيد من التحليل عند الضرورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا العمل اختبار المقايسة المناعية تعدد الإرسال لتحديد وقت واحد من الأنواع السيانوبكتيريا المياه العذبة الأكثر صلة (الجدول 1) باستخدام ميكروأري CYANOCHIP الأجسام المضادة. ميكروأري يمكن أن يكون شكل 3 × 8 ميكروأري المطبوعة على شرائح المجهر. ويتكون كل ميكروأري تتكون من مجموعة من 17 الأجسام المضادة المطبوعة في نمط بقعة ثلاث نسخ، والأجسام المضادة المناعية قبل المقابلة، وديوان الرقابة المالية والضوابط السلبية. تتضمن المجهرية أيضا إطار الفلورسنت، وذلك باستخدام fluorescently المسمى الأجسام المضادة قبل المناعة في توطين بسهولة نمط ميكروأري 22 (الشكل 1).
تم اختبار ميكروأري في مجال لفي الموقع تحليل عينات المياه التي تم جمعها على شاطئ المياه العذبة وزويا الخزان الذي يزود مدينة مدريد. تم تجهيز العينات كما هو موضح أعلاه، ويتفق immunoreactions الإيجابية الرئيسية لأجسام مضادة لالبكتيريا الزرقاء العوالق، مثل Microcystis النيابة. (K4 وK5)، والقاعية Oscillatoriales، مثل Leptolyngbya النيابة. (K10 و K15). تم الحصول على إشارات مضان أقل من نوستكيات (K6 وK12، واثنين من العوالق افانيزومينون النيابة.)، القاعية Rivularia ليرة سورية. (K8)، أنابينا ليرة سورية. (K1)، والعوالق Microcystis فلوس أكوي-س. (K3). أظهرت الملاحظات المجهر الضوئي (لا يظهر) مجتمع السيانوبكتيريا متنوعة داخل حطام القارية المزرية وفرة من الشاطئ. هيمنت عدة أنواع من أنابينا المجتمع، ولكن Microcystis النيابة. وPseudanabaena النيابة. كما حضر.
بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من صحة ميكروأري أيضا معايرة جافة، حصيرة الميكروبية تقريبا عمرها 1000 التي تم جمعها في الجرف الجليدي ماكموردو في القارة القطبية الجنوبية لاختبار وجود أماه السيانوبكتيرياrkers. ويبين الشكل 1 الفلورية للغاية، ردود فعل إيجابية في الأجسام المضادة المنتجة لالقاعية البكتيريا الزرقاء معزولة من الحصير القارة القطبية الجنوبية الأخرى، بما في ذلك أنابينا ليرة سورية. وLeptolyngbya النيابة. (K14 و K15، على التوالي). تم الكشف عن immunoreactions إيجابية إضافية مع الأجسام المضادة لالبكتيريا الزرقاء العوالق، مثل Microcystis النيابة. (K4 وK5)، افانيزومينون النيابة. (K6 وK12)، وPlanktothrix rubescens ليرة سورية. (K17). وقد تم الحصول على إشارات منخفضة من الأجسام المضادة لأنواع القاعية أخرى معزولة في القطب الجنوبي حصيرة، بما في ذلك س Tolypothrix. (K16) وأنابينا ليرة سورية. (K1). كشف المجهر الضوئي الفلورسنت وجود خلايا مشابهة بنيويا البكتيريا الزرقاء والطحالب الخضراء (لا يظهر). ولم تحدد أي البكتيريا الزرقاء الخيطية. ومع ذلك، تم الكشف عن العديد من الهياكل الفلورسنت غير متبلور من حوالي 1 ميكرون في الحجم ومضان منتشر غزير، مبادرة الخوذ البيضاءويمكن أن يعزى الفصل إلى وجود بقايا الخلية (مكسورة والخلايا الميتة) والمواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)، على التوالي. وفقا لذلك، أظهر التحليل الكيميائي أن حصيرة تتكون من كميات وافرة من البوليمرات الحيوية وبقايا الخلية (مسألة بيولوجية معقدة) التي يمكن أن تكون أهدافا لأجسام مضادة في ميكروأري.
الشكل 1: سريع وموثوق بها المتعددة ميكروأري المناعية للكشف البكتيريا الزرقاء. أ) مخطط يبين الخطوات الرئيسية للFSMI لتحليل عينات متعدد الاهداف مع CYANOCHIP. ب) رسم تخطيطي للتخطيط نمط الطباعة (من ثلاث نسخ) من مجموعة مكافحة البكتيريا الزرقاء الأجسام المضادة: (0) BSA، ألبومين المصل البقري. (X) فقط طباعة العازلة؛ (1-17) كل من الأجسام المضادة كما في الجدول رقم 1 في بLANCO وآخرون. 2015 (K1 إلى K17). من P1 إلى P17، والأجسام المضادة المناعية قبل المقابلة بمثابة الضوابط. المستطيلات الصفراء تتوافق مع التدرج بقعة الفلورسنت كمرجع الإطار. C و D) صورة تظهر في الجزء العلوي من حصيرة الميكروبية الجافة عمرها 1،000 من ماكموردو الجرف الجليدي (القارة القطبية الجنوبية) وصورة CYANOCHIP الكشف عن البكتيريا الزرقاء في هذا حصيرة، على التوالي. E) منظر بانورامي للوزويا خزان تبين مياه شفافة مع عدم وجود جزيئات الخضراء وضوحا في وقت أخذ العينات. F) صورة ميكروأري بعد في الموقع تحليل عينة المياه (معدلة من مرجع 22).
| كود أب | مستمنع (سلالة) | طلب | موطن | | شروط الثقافة | |
| K1 | أنابينا ليرة سورية. | نوستكيات | غير معروف | BG11 ونترات | 30 درجة مئوية، وعلى ضوء مستمر |
| K2 | أنابينا ليرة سورية. | نوستكيات | غير معروف | BG11o | 30 درجة مئوية، وعلى ضوء مستمر |
| K3 | Microcystis فلوس-أكوي | Chroococcales | العوالق | BG11 | 28 درجة مئوية، وعلى ضوء مستمر |
| K4 | Microcystis novacekii | Chroococcales | العوالق | BG11 | 28 درجة مئوية، وعلى ضوء مستمر |
| K5 | Microcystis الزنجارية | Chroococcales | العوالق | BG11 | 28 درجة مئوية، وعلى ضوء مستمر |
| K6 | افانيزومينون ovalisporum | نوستكيات | العوالق | BG11o | 28 درجة مئوية، وعلى ضوء مستمر |
| K7 | Phormidium ليرة سورية. | Oscillatoriales | القاعية | BG11 | 18 درجة مئوية، 16-8 الضوئية |
| K8 | Rivularia ليرة سورية. | نوستكيات | القاعية | تشو-D | 18 درجة مئوية، 16-8 الضوئية |
| K9 | Chamaesiphon ليرة سورية. | Chroococcales | القاعية | BG11 | 18 درجة مئوية، 16-8 الضوئية |
| K10 | Leptolyngbya بوريانا | Oscillatoriales | القاعية | BG11 | 18 درجة مئوية، 16-8 الضوئية |
| K11 | Tolypothrix distorta | نوستكيات | القاعية | BG11o | 18 درجة مئوية، 16-8 الضوئية |
| K12 | aphanizomenoides افانيزومينون | نوستكيات | العوالق | BG11o | 28 درجة مئوية، وعلى ضوء مستمر |
| K13 | نوستوك ليرة سورية. (القارة القطبية الجنوبية) | نوستكيات | القاعية | BG11o | 13 درجة مئوية، 16-8 الضوئية |
| K14 | أنابينا ليرة سورية. | نوستكيات | القاعية | BG11o | 13 درجة مئوية، 16-8 الضوئية |
| K15 | Leptolyngbya ليرة سورية. | Oscillatoriales | القاعية | BG11 | 13 درجة مئوية، 16-8 الضوئية |
| K16 | Tolypothrix ليرة سورية. | نوستكيات | القاعية | BG11 | 13 درجة مئوية، 16-8 الضوئية |
| K17 | rubescens Planktothrix | Oscillatoriales | planktoشركة الاستثمارات الوطنية | لا شيء | لا شيء |
الجدول 1. قائمة الأجسام المضادة (عبس) وسلالات السيانوبكتيريا المستخدمة لإنتاج CYANOCHIP 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، يتم وصف لتعدد الإرسال الفلورسنت شطيرة المناعية باستخدام CYANOCHIP، ميكروأري 17-الأجسام المضادة للكشف والتعرف على مجموعة واسعة من أجناس السيانوبكتيريا، 22. وتمثل هذه البكتيريا الزرقاء أجناس القاعية والعوالق الأكثر شيوعا في موائل المياه العذبة، وبعضهم من المنتجين السم يجري. مؤخرا، تم استخدام شكل شطيرة المناعية الفلورسنت لتحديد الكائنات الحية الدقيقة و / أو bioanalytes في التطبيقات البيئية 26، 27، 28. ويستند في المقام الأول على بروتوكول خطوتين: (ط) شل حركة أو التقاط الأجسام المضادة لربط تحديدا التحاليل من عينة الاختبار و (ب) الكشف عن أزواج تحليلها الأجسام المضادة باستخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى (التتبع أو للكشف عن الأجسام المضادة). لأن فحص شطيرة يتطلب اثنين على الأقل من الأجسام المضادة ملزمة مواقع يمكن الوصول إليها (الحواتم) في تحليلها لرد الفعل على اتخاذ مكان وفي أي إشارة الفلورسنت إيجابية يدل على وجود oligo- أو multimeric التحاليل الكبيرة والمعقدة نسبيا التي هي مطابقة أو مشابهة جدا لتلك التي استخدمت لإنتاج الأجسام المضادة اسر.
على الرغم من أن هذا الأسلوب يتطلب كميات صغيرة وإعداد نموذج الأساسي، دون الحاجة إلى خبرة أو معرفة خاصة، يمكن أن عدة عيوب الخراب الفحص. إشارات الفلورسنت منخفضة أو انعدام تام منه قد يكون راجعا إلى سوء تنقية الأجسام المضادة أو ضعف كفاءة وضع العلامات. لعزل مفتش أرنب، البروتين (أ) هو الخيار الأفضل، لأنه يربط على وجه التحديد مع كفاءة عالية في المنطقة التيسير المناعية. كما هو مبين في المادة 4، والأجسام المضادة الفلورسنت مع مجموعة العلامات بين 3-7 مول صبغة لكل مول من الأجسام المضادة يجب أن تستخدم. وعلاوة على ذلك، عدم وجود البقع الفلورسنت يمكن تفسير تركيز التحاليل الكذب تحت حدود الكشف. في هذه الحالة، يمكن أن تكون العينة اضربentrated قبل احتضان مع ميكروأري، أو كميات أكبر يمكن استخدامها لاستخراج الجديد. خلفيات الفلورسنت عالية هي نتيجة لحجب رقاقة غير فعالة و / أو غسل الخطوات ومقتطفات من عينات تتكون من المعادن والمواد العضوية المعقدة التي تلتصق على رقاقة. عندما تستخدم عينات معقدة مثل التحاليل، فمن المستحسن أن زيادة الملح و / أو تركيز المنظفات لصالح تفاعل معين بين أزواج تحليلها الأجسام المضادة.
في السنوات الأخيرة، وقد تم تطوير تكنولوجيا الأجسام المضادة ميكروأري في التطبيقات البيئية. ومع ذلك، فإن استخدام هذه التقنية لا تنطوي على بعض القيود. الأجسام المضادة هي أسرع وأرخص للإنتاج، والأهم، إمكانية ربط أي حاتمة الهدف في عينة بيئية معقدة هي أعلى نظريا من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. ومع ذلك، فإن حقيقة أنها يمكن أن تعترف الحواتم مختلفة يزيد من عدد من ردود الفعل عبر في ولايات ميكرونيزيا الموحدةأولا لكسب خصوصية عالية، واستخدام وسائل لفصل هذه الأحداث عبر التفاعل من ردود الفعل ضد مستضد المشابهة الحقيقية باستخدام أساليب deconvolution 26، 27، على سبيل المثال، غير مرغوب فيه للغاية. في الأساس، يعتبر ميكروأري جهاز الاستشعار البيولوجي النوعي للكشف عن عدة وتصنيف البكتيريا الزرقاء. وفي هذا الصدد، لا بد من تحديد الحد من الكشف عن الأجسام المضادة لكل واحدة تلو الأخرى إلى استخدام تركيزات العمل الأمثل في الفحص. على الرغم من أن هذا ميكروأري، جنبا إلى جنب مع FSMI، لا تعتبر الأسلوب الكمي، وجهاز الاستشعار البيولوجي يعني حساسية عالية، وذلك لأن حد الكشف أقل من معظم الأجسام المضادة الواردة في CYANOCHIP 22 هو من 10 فبراير - 10 مارس خلية / مل.
وعلى الرغم من هذه القيود، هذه المنهجية لديها العديد من المزايا ضد غيرها من التقنيات المستخدمة في م البيئيonitoring. الأجسام المضادة أجهزة الاستشعار تسمح إمكانية الاعتراف جزيئات مختلفة في نفس الوقت في تحليل واحد، وإمكانية الكشف عن تركيز منخفض من التحاليل، وإمكانية إنتاج الأجسام المضادة ضد مادة أي تقريبا. وعلاوة على ذلك، يمكن للميكروأري تحقيق ما يصل إلى 24 يحلل في فحص واحد، مع حدود الكشف من 10 2 خلية / مل. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، يمكن أن الأجسام المضادة كشف المعيشة أو الخلايا الميتة، المواد خارج الخلية، والحطام الخلوي. على الرغم من أنه يأخذ 4 ساعة على الأقل لإتمام الفحص كله، وهو أسرع من الأساليب التحليلية الأخرى المطبقة للرصد البيئي. وكان ينظر إلى CYANOCHIP أصلا لتحديد سلالات السيانوبكتيريا. لم يتم تصميم هذا جهاز الاستشعار البيولوجي رسميا لهذا الغرض، لذلك يمكن تحديد المنتجين السم محتمل ويمكن تحسينها في المستقبل بإضافة الأجسام المضادة ضد طائفة واسعة من سلالات جديدة. فحوصات الكيمياء الحيوية، مثل إليسا، PPIA، والكيميائية العصبيةتجارب على الفئران، تسمح بتحديد cyanotoxins، لكنها تقتصر على عدد قليل من كثير من السموم ويمكن أن تعطي ايجابيات كاذبة. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام CYANOCHIP لا تتطلب تدريبا خاصا، في حين تتطلب البصرية المجهر والفأر اختبارات بيولوجية الموظفين المدربين أو عمل كثيفة العمالة مع الحيوانات الحية، وأنها لا تعطي معلومات حول نوع من السموم الموجودة في العينة. ويمكن أيضا Cyanotoxins تحديدها كميا وبالطرق التحليلية الأخرى، مثل HPLC، GC-MS، أو MALDI-TOF. في هذه الأساليب، يجب تنقية العينة، وعدم وجود معايير مرجعية يحد من تحديد cyanotoxins. وعلاوة على ذلك، الأساليب التحليلية تتطلب معدات ولوازم مكلفة والتدريب المتخصص. تستند الأساليب الجزيئية في استخراج الحمض النووي من العينات، في حين FSMI يتطلب فقط مقتطف البيئي أعدت في بضع خطوات بسيطة للغاية، دون تنقية البكتيريا الزرقاء.
الأداء العالي للCYANOCHIP لفي الوضع الطبيعي الكشف عن البكتيريا الزرقاء في خزانات المياه العذبة يجعل منه أداة جديدة للإنذار المبكر لمديري المياه. وبالإضافة إلى ذلك، ميكروأري المثير للاهتمام أيضا لمجال بيولوجيا الفضاء، وخاصة للبحث عن علامات الميكروبية كدليل على الحياة. دراسة القاسية يمكن أن تساعدنا على فهم أصل الحياة على الأرض، وكيف الحياة يمكن البقاء على قيد الحياة في البيئات القاسية الموجودة في مجموعتنا الشمسية وما وراءها. عن العديد من البيئات على الأرض هي مشابهة جدا لأماكن على الكواكب الأخرى، مثل المريخ، قد يكون من الممكن العثور على رفات بدائيات النوى الضوئي على النحو الذي يثبت الحياة المنقرضة. كان ميكروأري قادرا على تحديد علامات السيانوبكتيريا من حية أو غير حية الخلايا. من لا يزال السكان و / أو المواد خارج الخلية في الكائنات الجرثومية القديمة (الشكل 1). ومن المياه والتربة والصخور التي تم جمعها في البيئات القاسية، مثل القارة القطبية الجنوبية، أتاكاما، بحيرات جبال الأنديز، والقطب الشمالي العليا، أومنطقة ريو تينتو في إسبانيا (لا يظهر). وبالنظر إلى أن البكتيريا الزرقاء هي الكائنات الحية الدقيقة البدائية على الأرض، ليس هناك سبب للاعتقاد بأنهم قد مرة واحدة عاشوا على الكواكب الأخرى.
في الختام، أن CYANOCHIP-FSMI يمكن تحديد في علامات السيانوبكتيريا الموقع وحتى يمكن ربطها إلى phylotypes أو مجموعات مختلفة، وأن ميكروأري تغطي مجموعة واسعة من الموائل، بما في ذلك تلك العوالق، الكائنات البحرية، وendoliths، يدل على أن هذا يمكن أن تقنية أداة للرصد البيئي. يمكن أن تكون التحسينات المستقبلية لميكروأري لزيادة عدد الأجسام المضادة لسلالات جديدة بحيث مجموعة النشوء والتطور ذات الصلة لا تزال مدرجة معلقة. بالإضافة إلى ذلك، ورقاقة يمكن تنفيذها مع الأجسام المضادة للمركبات السيانوبكتيريا محددة، مثل السموم أو cyanophicin البوليمر. هذا مهم بشكل خاص لرصد مكامن المياه العذبة، والأنابيب، ومنشآت في مرافق الإنسان. وميكر الحاليسوف oarray والإصدارات المستقبلية أن تكون مفيدة جدا في مجال بيولوجيا الفضاء، إما للكشف عن الحياة أو لرصد المنشآت الإنسان في الفضاء (على سبيل المثال، مراقبة خزانات المياه أو أنظمة دعم الحياة). في الواقع، ونحن نستخدم بشكل روتيني ميكروأري في الحملات الميدانية إلى البيئات القاسية كوسيلة للكشف "في الموقع" الحياة لا يزال قائما. ميكروأري هو جزء من ما يسمى الحياة الكاشف رقاقة (LDChip)، ميكروأري مع أكثر من 300 الأجسام المضادة للبحث عن الحياة في بعثات استكشاف الكواكب 29، 30. وسيتم تنفيذ ميكروأري وحدها أو كجزء من LDChip في علامات الحياة الكاشف (الصلبة) أداة 29 للتحقق من صحة مفهوم الصلبة LDChip لاستكشاف الكواكب في الحملات الميدانية متعددة لنظائرها الأرضية. سوف ميكروأري توفير معلومات مفيدة عن طريق تحديد البكتيريا الزرقاء و / أو سمومها. من خلال تحديد السلالات، وسوف غيلقد المعلومات حول البيئات والموائل التي قاموا بتطويرها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر الدكتور أنطونيو كيسادا من جامعة مدريد المستقلة لتوفير سلالات السيانوبكتيريا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل Subdirección الجنرال دي PROYECTOS دي INVESTIGACION من الإسبان MINISTERIO دي ECONOMIA ذ Competitividad (MINECO)، لا تضمن أي. AYA2011-24803 وESP2014-58494-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0.5 mL tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10 - 12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
- Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
- Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
- Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
- Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
- Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
- Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
- Kegel, J. U., Del Amo,, Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
- Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
- Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
- Parro, V. Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 2699-2710 (2010).
- Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
- Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
- Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
- Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
- Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
- Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
- Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
- Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
- Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre,, Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., et al.
- Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
- Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
- Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
- Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
- McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).
