पता लगाने के लिए प्रायोगिक प्रोटोकॉल<em> Cyanobacteria</emएक एंटीबॉडी माइक्रोएरे चिप के साथ तरल और ठोस नमूने में>
Summary
The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.
Abstract
ग्लोबल वार्मिंग और eutrophication कुछ जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों सच के रूप में बायोरिएक्टर है कि तेजी से और बड़े पैमाने पर cyanobacterial विकास को गति प्रदान व्यवहार कर; इस प्रासंगिक स्वास्थ्य और आर्थिक परिणाम है। कई cyanobacterial उपभेदों विष निर्माता हैं, और केवल कुछ कोशिकाओं में पर्यावरण के लिए अपूरणीय क्षति प्रेरित करने के लिए आवश्यक हैं। इसलिए, पानी शरीर के अधिकारियों और प्रशासन तेजी से और कुशल प्रारंभिक चेतावनी प्रणाली विश्वसनीय डाटा उपलब्ध कराने के लिए अपने निवारक या उपचारात्मक फैसले का समर्थन करने के लिए आवश्यकता होती है। यह पांडुलिपि 17 एंटीबॉडी (पेट) वर्गीकरण संकल्प (CYANOCHIP) के साथ के साथ एक एंटीबॉडी माइक्रोएरे चिप का उपयोग करके विष उत्पादक cyanobacterial स्ट्रेन के में क्षेत्र का पता लगाने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। इधर, एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट सैंडविच माइक्रोएरे प्रतिरक्षा (FSMI) 17 cyanobacterial उपभेदों के एक साथ निगरानी के लिए अक्सर मीठे पानी के पारिस्थितिक तंत्र में खिल पाया गया है, उनमें से कुछ विष उत्पादकों, वर्णित है। बहु के साथ एक माइक्रोएरेमिसाल समान प्रतिकृति CYANOCHIP का (24 से ऊपर) के लिए एक एकल खुर्दबीन स्लाइड पर मुद्रित किया गया था एक साथ नमूनों की एक समान संख्या में परीक्षण करने के लिए। तरल नमूने या तो एंटीबॉडी (पेट) के साथ सीधे ऊष्मायन द्वारा या एक 1- से 3 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा सेल एकाग्रता के बाद परीक्षण किया जा सकता है। इस तरह के अवसादों और जमीन चट्टानों के रूप में ठोस नमूने, पहली homogenized और एक ऊष्मायन बफर में एक हाथ से आयोजित ultrasonicator द्वारा बिखरे हैं। वे तो छान रहे हैं (5 – 20 माइक्रोन) मोटे सामग्री को हटाने के लिए, और छानना पेट के साथ incubated है। Immunoreactions 17 प्रतिदीप्ति लेबल पेट का एक मिश्रण के साथ एक अंतिम ऊष्मायन से पता चला रहे हैं और एक पोर्टेबल प्रतिदीप्ति डिटेक्टर से पढ़ रहे हैं। पूरी प्रक्रिया के आसपास 3 घंटे लगते हैं, इसके बारे में सबसे ऊष्मायन के दो 1-एच अवधि के लिए इसी। उत्पादन एक छवि है, जहां चमकीले धब्बों cyanobacterial मार्कर के सकारात्मक पता लगाने के अनुरूप है।
Introduction
का पता लगाने और जटिल प्राकृतिक माइक्रोबियल समुदायों में सूक्ष्मजीवों की निगरानी बायोमेडिसिन, पर्यावरण पारिस्थितिकी, और Astrobiology सहित कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण हैं। Cyanobacteria प्रोकार्योटिक सूक्ष्मजीवों ताजा पानी में कोशिकाओं की खिलता (अत्यधिक प्रसार) के रूप में उनकी क्षमता के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। वे हर जगह हैं, और कई प्रजातियों, विषाक्त पदार्थों का उत्पादन करने के लिए अग्रणी न केवल मानव स्वास्थ्य के लिए एक संभावित खतरा है, लेकिन यह भी एक पारिस्थितिकी प्रभाव करने में सक्षम हैं। इस संबंध में, यह cyanobacteria और / या मिट्टी और पानी में उनके विषाक्त पदार्थों का जल्दी पता लगाने के लिए तेजी से और संवेदनशील तरीकों को विकसित करने के लिए आवश्यक है। इस प्रयोजन के लिए, एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट सैंडविच माइक्रोएरे प्रतिरक्षा (FSMI) पानी प्रबंधकों उन्हें निर्णय करने में मदद करने के लिए और इसके परिणामस्वरूप, उचित जल प्रबंधन कार्यक्रमों को लागू करने में एक उपकरण के रूप में विकसित किया गया है।
तरीकों की एक विविध रेंज का पता लगाने और सियान की पहचान करने के लिए विकसित किया गया हैobacterial कोशिकाओं और मिट्टी और पानी में cyanotoxins, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी, आणविक जीव विज्ञान, और प्रतिरक्षा तकनीक भी शामिल है। इन तरीकों में वे जानकारी प्रदान में काफी भिन्नता है सकते हैं। सूक्ष्म तकनीक सेल आकृति विज्ञान और इस तरह के रूप में phycocyanin cyanobacterial पिगमेंट, से इन विवो प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए या एक 1 क्लोरोफिल पर आधारित हैं। हालांकि वे वास्तविक समय और लगातार निगरानी के लिए त्वरित और सस्ता तरीकों कि प्रकार और एक नमूने में मौजूद cyanobacteria की संख्या के बारे में सूचित कर रहे हैं, वे संभावित विषाक्तता के बारे में जानकारी नहीं देते। इसके अलावा, वे विशेषज्ञता का एक निश्चित स्तर की आवश्यकता होती है, विचार है कि यह अक्सर बहुत निकट से संबंधित प्रजातियों 2 के बीच भेद करना मुश्किल है। इन सीमाओं को पार करने के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोपी दोनों जैविक और जैव रासायनिक स्क्रीनिंग assays और पहचान और cyanotoxins की मात्रा का ठहराव के लिए भौतिक तरीकों के साथ होना चाहिए।
<pवर्ग = "jove_content"> एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays (एलिसा), प्रोटीन फॉस्फेट निषेध assays (PPIA), और चूहों में नयूरोचेमिकल परीक्षण cyanotoxins का पता लगाने के लिए जैव रासायनिक स्क्रीनिंग assays के उदाहरण हैं। पहले दो तेजी से और संवेदनशील तरीके हैं, झूठी सकारात्मक वर्णित किया गया है का उपयोग करते समय एलिसा और PPIA परीक्षण विषाक्त पदार्थों के तीन प्रकार के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं। माउस bioassay कम संवेदनशीलता और सटीक है, और विशेष लाइसेंस और प्रशिक्षण के साथ एक गुणात्मक तकनीक की आवश्यकता है। इसके अलावा, यह एक नमूने में मौजूद विषाक्त पदार्थों के प्रकार के बारे में जानकारी देना नहीं है। Cyanotoxins पहचान की है और इस तरह के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी के रूप में अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों, (एचपीएलसी), तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (नियंत्रण रेखा एमएस), गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी), गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी एमएस), या उड़ान के मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण समय (MALDI-TOF)। हालांकि, यह तभी संभव है यदि संदर्भ मानकों, जो की जरूरत हैजटिल नमूने में अलग-अलग विष सांद्रता निर्धारित करने के लिए एड, उपलब्ध 3, 4 कर रहे हैं। इसके अलावा, इन तरीकों समय लेने वाली हैं; महंगे उपकरण, आपूर्ति, और नमूना तैयार करने की आवश्यकता होती है; और अनुभवी और विशेष स्टाफ द्वारा किया जाना चाहिए।आण्विक आधारित विधियों दशकों का पता लगाने की पहचान है, और cyanobacteria और उनके इसी cyanotoxins यों तो जीनोम डेटाबेस में प्रकाशित अनुक्रम जानकारी के लिए धन्यवाद के लिए लागू किया गया है (जैसे, जैव प्रौद्योगिकी सूचना, एन सी बी आई के लिए राष्ट्रीय केन्द्र)। इन तरीकों के अलावा पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) है, जो डीएनए प्रवर्धन के लिए प्राइमरों के सेट की डिजाइन की आवश्यकता है और विभिन्न प्रजातियों के cyanobacterial डीएनए दृश्यों के पिछले ज्ञान पर निर्भर करते हैं पर आधारित होते हैं। जीन का पता लगाने, phycocyanin operon तरह, जीनस स्तर पर सटीक पहचान करने के लिए होता है, कुछ प्रजातियों या प्रकारों के साथ नहीं चल पाता हैंयह विधि। हालांकि, इस तरह microcystin operon से संबंधित उन के रूप में विष एन्कोडिंग जीन, नमूने में जहर की पहचान जहां उत्पादकों दुर्लभ 5 की सुविधा। बहरहाल, पीसीआर द्वारा विष मार्कर का पता लगाने के लिए जरूरी माहौल में विषाक्तता मतलब नहीं है। इसके अलावा, एक नमूने में मौजूद cyanobacteria और विष उत्पादकों की प्रजातियों की पूरी रेंज का विश्लेषण करने के लिए विकसित प्राइमरों के सेट अभी भी अधूरा है, और आगे की पढ़ाई अज्ञात प्रजातियों की पहचान करने के लिए किया जाना चाहिए। अन्य आणविक तकनीक ऐसी सीटू संकरण (मछली) और डीएनए में प्रतिदीप्ति के रूप में गैर-पीसीआर आधारित कर रहे हैं।
पिछले दो दशकों में, माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी महत्व आवेदन के कई क्षेत्रों में, विशेष रूप से पर्यावरण निगरानी में इजाफा हुआ है। डीएनए प्रजातियों और analytes 4 के बीच भेदभाव, 6, 7 के लिए अनुमति </sup>, 8, 9, 10, लेकिन वे बहुत ही कठिन और समय लेने वाली कार्य है कि कई कदम (जैसे, माइक्रोएरे प्रदर्शन, डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर प्रवर्धन, और संकरण) को शामिल माना जाता है। कारण है कि, कम समय लेने वाली ऐसी सैंडविच और प्रतिस्पर्धी प्रतिरक्षा प्रोटीन के रूप में एंटीबॉडी, पर आधारित assays, कई पर्यावरण analytes 11, 12, 13 का पता लगाने के लिए एक अनिवार्य और विश्वसनीय उच्च throughput विधि बन गए हैं। एंटीबॉडी की क्षमता विशेष रूप से उनके लक्ष्य यौगिकों की पहचान करने के लिए और, analytes और प्रोटीन की थोड़ी मात्रा का पता लगाने के लिए लगभग किसी भी पदार्थ के खिलाफ एंटीबॉडी के उत्पादन की संभावना के साथ-साथ, एंटीबॉडी पर्यावरण उद्देश्यों के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बनाते हैं। इसके अलावा, कई को प्राप्त करने की क्षमता के रूप में विश्लेषण करती हैचिमनी परख, पीपीएम पीपीबी से लेकर पता लगाने की सीमा के साथ, इस विधि 14 का मुख्य लाभ में से एक है।
एंटीबॉडी आधारित biosensors पर्यावरण निगरानी 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 में रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने के लिए संवेदनशील और तेजी से उपकरण साबित हुई है। जबकि डीएनए तरीकों कई कदम शामिल है, एंटीबॉडी आधारित प्रोटीन केवल एक छोटा सा नमूना तैयार है कि मुख्य रूप से एक उचित समाधान बफर में एक छोटे से सेल कदम पर आधारित है की आवश्यकता होती है। Delehanty और Ligler 15 एक एंटीबॉडी सैंडविच प्रतिरक्षा 4 पीपीबी एक के एक प्रोटीन एकाग्रता पता लगाने में सक्षम पर आधारित प्रोटीन और जटिल मिश्रण में बैक्टीरिया analytes के एक साथ पता लगाने की सूचना दीडी 10 4 CFU / एमएल कोशिकाओं की। Szkoła एट अल। 21 कि जैविक युद्ध में इस्तेमाल किया जा सकता है proteotoxins और छोटे जहर, यौगिकों के एक साथ पता लगाने के लिए एक सस्ता और विश्वसनीय मल्टीप्लेक्स माइक्रोएरे विकसित किया है। वे ricin विष की सांद्रता का पता चला, कम से कम 20 मिनट में 3 पीपीबी, का पता लगाने की एक सीमा के साथ। हाल ही में, CYANOCHIP, विषाक्त और nontoxic cyanobacteria के बगल में पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी माइक्रोएरे आधारित biosensor, 22 में वर्णित किया गया है। इस माइक्रोएरे ज्यादातर जलीय वातावरण, जो microscopically की पहचान करना मुश्किल है, संभावित cyanobacterial खिलता की पहचान के लिए अनुमति देता है। अधिकांश प्रजातियों के लिए 10 3 कोशिकाओं, यहां तक कि प्रजातियों के स्तर पर, मल्टीप्लेक्स का पता लगाने और cyanobacteria की पहचान के लिए एक लागत प्रभावी उपकरण में इस biosensor मोड़ – माइक्रोएरे का पता लगाने की सीमा 10 2 है। इन सभी गुणों antibo बनानावि माइक्रोएरे तकनीक, और विशेष रूप से विधि इस काम में प्रस्तुत किया, एक तेज और सरल विधि aforementioned तकनीकों की तुलना में।
इस काम के प्रयोगों है कि मिट्टी और पानी के नमूनों में cyanobacteria की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी माइक्रोएरे आधारित biosensor उपयोग के दो उदाहरण प्रस्तुत करता है। यह एक सरल और विश्वसनीय विधि एक सैंडविच प्रतिरक्षा प्रारूप पर आधारित है कि बहुत छोटा सा नमूना मात्रा और बहुत ही बुनियादी नमूना तैयार करने की आवश्यकता है। विधि एक कम समय की आवश्यकता है और आसानी से क्षेत्र में किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इधर, एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट सैंडविच CYANOCHIP, पता लगाने और cyanobacterial पीढ़ी की एक विस्तृत श्रृंखला की पहचान के लिए एक 17 एंटीबॉडी माइक्रोएरे, का उपयोग प्रतिरक्षा 22 में वर्णित है। ये cyanobacteria, उनमें से …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम cyanobacterial उपभेदों प्रदान करने के लिए Universidad ऑटोनोमा डे मैड्रिड से डा एंटोनियो Quesada धन्यवाद। इस काम Subdirección जनरल डी PROYECTOS डे स्पेनिश Ministerio de Economía y Competitividad की Investigación (MINECO) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, कोई अनुदान। AYA2011-24803 और ESP2014-58494 आर।
Materials
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X) | Thermofisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2X | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0,5 ml tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10-12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
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